Лада проекта 677: Что за подлодка проекта 677 «Лада» «Великие Луки» спущена на воду? | Армия

Содержание

Что за подлодка проекта 677 «Лада» «Великие Луки» спущена на воду? | Армия | Общество

23.12.2022 20:02

Алексей Козаченко

Примерное время чтения: 3 минуты

2555

Категория: Военная промышленность

В Санкт-Петербурге состоялась церемония спуска на воду новой дизель-электрической подводной лодки (ДЭПЛ) «Великие Луки» проекта 677 «Лада». Эта субмарина построена по современному проекту, который считается самым бесшумным среди дизель-электрических подлодок. В конце года начнутся её государственные испытания, передача флоту запланирована на следующий год.

В настоящее время сформирован экипаж подлодки, который занимается изучением вооружения, оборудования и технических средств подлодки. «Великие Луки» получила современные системы управления корабельными техническими средствами электродвижения, навигационный комплекс, что значительно повысило ее уровень автоматизации.

Подводная лодка «Великие Луки» проекта 677 «Лада» перед спуском на воду. Фото: РИА Новости/ Пресс-служба АО

Подводные лодки проекта 677 «Лада» — серия российских многоцелевых дизель-электрических подводных лодок четвёртого поколения, разработанных в «ЦКБ Рубин». Головная лодка этого проекта «Санкт-Петербург» в конце прошлого года вошла в боевой состав Северного флота. Следующая, первая серийная подлодка «Кронштадт», была построена уже по усовершенствованному проекту, который стал итогом опытной эксплуатации головной субмарины этого проекта. Сообщалось, что она войдёт в состав ВМФ до конца следующего года.

Подводные лодки, построенные по проекту 677 «Лада», являются самыми современными представителями этого класса, превосходя российских и иностранных конкурентов по боевой эффективности и другим тактико-техническим характеристикам. При их создании применялись современные конструкционные технические решения, которые позволили значительно снизить их шумность внутри корпуса. Также подлодка получила многорежимную силовую установку, которая работает тише традиционных асинхронных электродвигателей.

Подлодки 677 «Лада» должны были стать первыми российскими подводными лодками с аэробной установкой замкнутого цикла. Такие субмарины получают возможность в автономном режиме без всплытия находиться под водой несколько недель, поскольку подзарядка аккумуляторов может производиться в автономном режиме. Но из-за задержек при разработке аэробного двигателя было принято решение на первых трёх подлодках установить классические дизель-электрические установки. На последующих лодках серии будут воздухонезависимые двигатели. В настоящее время продолжается их разработка.

По проекту 677 «Лада» на предприятии «Адмиралтейские верфи» строятся подлодки с водоизмещением в 1,8 тыс. тонн. Эта субмарина способна развивать скорость более 20 узлов, глубина погружения составляет более трёхсот метров. Подлодка может находиться в автономном плавании полтора месяца. Экипаж корабля составляет 36 человек. В настоящее время в стадии строительства находятся ещё две лодки этого класса — «Вологда» и «Ярославль», на строительство ещё одного корабля — «Севастополь» — подписан контракт.

На вооружении подводных лодок проекта 677 находится ракетный комплекс «Калибр-ПЛ». Также на борту шесть торпедных аппаратов калибра 533 мм, 18 торпед УСЭТ-80К и мины.

Великие Лукиподводная лодкапроект 677 Лада

Следующий материал

Новости СМИ2

Спущена на воду подводная лодка «Великие Луки» проекта 677

Спущена на воду подводная лодка «Великие Луки» проекта 677

: bmpd; December 23rd, 2022

На АО «Адмиралтейские верфи» (входит в АО «Объединенная судостроительная корпорация» — ОСК) в Санкт-Петербурге 23 декабря 2022 года состоялась церемония спуска на воду через спусковой плавучий док строящейся для Военно-морского флота России большой дизель-электрической подводной лодки Б-587 «Великие Луки» (заводской номер 01572) — третьей подводной лодки проекта 677 (шифр «Лада»), являющейся одним из «долгостроев» российского военного кораблестроения. На церемонии спуска присутствовал генеральный директор ОСК Алексей Рахманов.

Церемония спуска на воду на АО «Адмиралтейские верфи» строящейся для ВМФ России большой дизель-электрической подводной лодки Б-587 «Великие Луки» (заводской номер 01572) проекта 677 (шифр «Лада»). Санкт-Петербург, 23.12.2022 (с) АО «Объединенная судостроительная корпорация»

Третья подводная лодка проекта 677 с заводским номером 01572 была заложена на АО «Адмиралтейские верфи» 10 ноября 2006 года под названием Б-587 «Севастополь». В 2009 году по решению Министерства обороны России строительство второго и третьего («Кронштадт» и «Севастополь») кораблей проекта 677 было приостановлено до передачи в опытную эксплуатацию головной подводной лодки проекта 677 Б-585 «Санкт-Петербург». В октябре 2013 года наименование «Севастополь» приказом Главнокомандующего ВМФ России было для данной лодки упразднено и передано заказанному во Франции для ВМФ России универсальному десантному кораблю типа Mistral. Контракт на постройку третьей подводной лодки проекта 677 по корректированному техническому проекту был заключен заводом в декабре 2014 года. 19 марта 2015 года подводная лодка проекта 677

Б-587 (заводской номер 01572) была перезаложена на АО «Адмиралтейские верфи» под названием «Великие Луки».

В июле 2017 года на Международном военно-морском салоне МВМС-2017 в Санкт-Петербурге генеральный директор АО «Адмиралтейские верфи» Александр Бузаков заявлял, что по условиям государственных контрактов сдача подводных лодок «Кронштадт» и «Великие Луки» ВМФ России намечена на 2020 и 2021 годы соответственно. Сейчас сроком сдачи лодки «Великие Луки» называется уже 2024 год.

Разработка неатомной подводной лодки нового поколения проекта 677 (проект 06770, шифр «Лада») осуществлялась АО «ЦКБ МТ «Рубин» с начала 1980-х годов. Головная подводная лодка проекта 677 Б-585 «Санкт-Петербург» (заводской номер 01570) была заложена на АО «Адмиралтейские верфи» 26 декабря 1997 года. Однако строительство лодки растянулось на длительное время и она была спущена на воду только 28 октября 2004 года и вышла на заводские ходовые испытания в 2007 году. 22 апреля 2010 года подводная лодка

«Санкт-Петербург» была принята ВМФ России, однако затем более десятилетия находилась в опытной эксплуатации на Северном флоте, и только 21 сентября 2021 года была введена в боевой состав ВМФ. В апреле 2020 года лодка перешла снова на Балтийское море и в настоящее время находится в составе Балтийского флота.

Вторая подводная лодка проекта 677 Б-586 «Кронштадт» (заводской номер 01571) была заложена на АО «Адмиралтейские верфи» 28 июля 2005 года. В 2009 году по решению Министерства обороны России строительство второго и третьего («Кронштадт» и «Севастополь») кораблей проекта 677 было приостановлено до передачи в опытную эксплуатацию головной подводной лодки проекта 677 Б-585 «Санкт-Петербург». Государственный контракт на возобновление строительства подводной лодки Б-586 «Кронштадт»

по корректированному техническому проекту был подписан в июле 2013 года.

Подводная лодка «Кронштадт» в итоге была спущена на воду на АО «Адмиралтейские верфи» 20 сентября 2018 года, а вышла на заводские ходовые испытания только 17 декабря 2021 года, в декабре 2022 года были начаты ее Государственные испытания.

По итогам достройки «Кронштадта» ВМФ России предпринял попытку возобновить серийное строительство подводных лодок по модифицированному проекту 677. В июне 2019 года в рамках Международного военно-технического форума «Армия-2019» был подписан контракт между Министерством обороны Российской Федерации и АО «Адмиралтейские верфи» на строительство для ВМФ России четвертой и пятой подводных лодок проекта 677. Их закладка под названиями «Вологда» (заводской номер 01573) и «Ярославль» (заводской номер 01574) была произведена на АО «Адмиралтейские верфи» 12 июня 2022 года.

25 августа 2020 года в рамках Международного военно-технического форума «Армия-2020» Министерство обороны России подписало контракт на строительство еще одной подводной лодки проекта 677, которая тем самым должна стать шестой единицей этого типа.

В ноябре 2018 года тогдашний Главнокомандующий Военно-Морским флотом Российской Федерации адмирал Владимир Королёв заявил, что планируется серийное строительство для ВМФ «не менее 12 единиц новейших дизель-электрических подводных лодок типа «Лада».

Видео:

Tags: ОСК, Россия, подводные лодки, проект 677, судостроение, флот

ПЛ «Лада» пр.677

Боевые действия на море имеют массу особенностей. Недаром служба на флоте всегда считалась особо почетной, а звание «адмирал» почти всегда ценилось выше генеральского чина. Одной из особенностей боя на воде является то, что всегда можно ожидать атаки не только со стороны надводных кораблей и авиации противника, но и из-под воды.

Подводные лодки немцев стали кошмаром для союзников во время Второй мировой войны, отправив на дно Атлантики миллионы тонн грузов и тысячи кораблей. Советский Союз высоко оценил вклад Германии в развитие подводного флота, начав в послевоенный период широкое развитие в этом направлении.

При произнесении слова «подводная лодка» у большинства людей сразу возникает ассоциация с огромным кораблем атомных подводных лодок, несущим на борту смертоносный груз в виде тяжелых баллистических ракет, способных доставить вероятным противнику огромные проблемы. При этом обыватели забывают, что не менее ценны в современном флоте и малые дизель-электрические подводные лодки. Они незаменимы в диверсионном деле, для тайной высадки десанта на берег противника.

Одним из самых удачных проектов стала подводная лодка «Лада». Об этом мы расскажем сегодня.

Общая информация

Корабли проекта 667 предназначены для проведения разведывательно-диверсионных мероприятий против надводных кораблей и подводных лодок противника, защиты прибрежных районов от десантов противника, а также для постановки минных заграждений и других подобных задач. Таким образом, подводная лодка «Лада», фото которой есть в статье, оптимально подходит для задач современной войны, требующей максимальной мобильности и незаметности.

Особенностью подводных лодок этой серии является схема их построения, получившая название «полуторка». Дело в том, что корпус (из стали АВ-2) имеет одинаковый диаметр по всей длине. В отличие от больших атомоходов нос и корма имеют четко выраженную сферическую форму. Благодаря переборкам корпус разделен на пять независимых отсеков. На корабле три палубы.

Впечатляющие гидродинамические характеристики обеспечиваются благодаря корпусу специально разработанной, особенно хорошо обтекаемой формы. Выдвижные устройства имеют точно такую же обструкцию, как и у кораблей 877 проекта, но кормовое оперение имеет крестообразную форму, а передние рули установлены на надгусеничном пространстве. Это сделано для того, чтобы они как можно меньше создавали помех работе гидроакустической аппаратуры, которой оснащена подводная лодка. Проект «Жигули» в этом смысле является настоящим эталоном: он чрезвычайно тихий, его крайне сложно обнаружить средствами сонара и гидроакустики.

Вооружение подводной лодки

Основными средствами защиты и нападения являются шесть аппаратов для пуска торпед калибром 533 мм, с двумя шахтами на верхней палубе, предназначенными для стрельбы управляемыми боеприпасами. Стандартный боекомплект включает 18 торпед. Чаще всего ПЛ Лада 677 использует боеприпасы универсального типа (САЭТ-60М, УГСТ), специальные торпеды для уничтожения подводных лодок противника. На борту могут быть крылатые ракеты, а также 22 мины модели ДМ-1. Имеется возможность боевого применения противолодочных ракет типа «Шквал».

Система управления огнем позволяет вести как одиночную, так и залповую стрельбу из шести мин одновременно. За перезарядку торпедных аппаратов отвечает комплекс «Мурена», позволяющий проводить всю операцию в полностью автоматическом режиме. Весь процесс полностью контролируется с командного пункта, которым оборудована подводная лодка. Проект «Лада» стал первой в Советском Союзе разработкой неатомной подводной лодки, в которой использовалось бы столько сложной и высокоэффективной автоматики.

Для обеспечения защиты катера от боевой авиации противника экипаж может использовать шесть ПЗРК модели «Игла-1М». Согласованность всех боевых систем обеспечивается за счет использования системы «Литий». Таким образом, подводная лодка «Лада», вооружение которой мы расписали, при своих малых габаритах способно доставить большие проблемы любому противнику.

Гидроакустический комплекс

Для гидроакустической разведки предназначен комплекс «Лира», в состав которого входят мощные чувствительные антенны. Установка состоит из трех антенн, одна из которых расположена на носу подводной лодки, а две — установлены на ее бортах. Инженеры максимально увеличили их диаметр для точного измерения подводного шума. Итак, передняя антенна занимает почти все пространство на носу подлодки. На случай повреждения бортового оборудования имеется выпускаемое гидроакустическое оборудование, которое ПЛ «Лада» (проект 677) может буксировать за собой на марше.

Навигационная система

Навигационная система — инерциального типа. Отвечает за предоставление данных о точном местоположении корабля, а также за определение оптимальной скорости, при которой бортовое вооружение может быть использовано с максимальной эффективностью.

В составе системы имеется перископическое оборудование типа УПК «Парус-98», в состав которого входят следующие элементы:

Непроницаемый перископ командирский «Парус-98КП». Имеет дневные и низкоуровневые каналы (оптические и ТВ). Степень увеличения варьируется от 1,5 до 12Х, есть возможность видеозаписи наблюдаемых данных.
Мачта оптронная непробиваемая типа «Парус-98УП». По сути, это многофункциональный универсальный перископ. В составе конструкции — два канала (дневной и низкоуровневый), степень увеличения — как в командирской зрительной трубе, имеется высокоэффективный лазерный дальномер.

Таким образом, подводная лодка «Лада», ТТХ которой мы кратко расписали, может с одинаковым успехом применяться в дневных и ночных условиях. Она всегда остается невидимой для врага.

Прочие элементы навигационной системы

Важнейшим элементом является радиолокационная система радиолокационной модели KRM-66 Kodak. Включает в себя активный и пассивный радиоканалы, может работать в комбинированном режиме. При активном использовании может активироваться специально защищенный, скрытый канал связи. Он дает полное представление об окружающей подводной среде (в том числе надводной), но не демаскирует корабль. В этом смысле подводная лодка «Лада» (проект 677) является во многом уникальным объектом, не имеющим аналогов в мире, как бы избито не звучала эта фраза.

Система цифровой связи модели «Дистанция». Позволяет обмениваться информацией по двунаправленному защищенному информационному каналу с береговыми командными пунктами, кораблями и самолетами (при условии их нахождения на перископной глубине). При необходимости отправить срочное сообщение с большой глубины используется вытяжная буксируемая антенна. Это снаряжение находится в особо прочном корпусе, способном защитить его даже в случае боевых действий. Проще говоря, «Жигули» — лодка очень живучая.

Наконец, комплекс навигационного оборудования «Аппассионата». Содержит инерциальную навигационную систему, а также модуль спутниковой навигации GPS/ГЛОНАСС. Точность определения местоположения при его использовании чрезвычайно высока, но зависит от близости настройки базовой станции к конкретному «провайдеру».

Силовая установка

«Сердцем» подводной лодки является дизель-электрическая энергетическая установка, выполненная по схеме, предусматривающей движение только по электрическому пути. Именно это отличает подводную лодку «Лада» от зарубежных аналогов. ТТС (транспортно-технические системы) иностранных судов этого класса могут обеспечить движение только на дизеле.

Дизельный двигатель находится в четвертом отсеке. Для выработки электроэнергии используются два генератора 28ДГ, соединенные с выпрямителями мощностью по 1000 кВт каждый. Энергия хранится в двух группах аккумуляторов. В каждом из них по 126 элементов (они в первом и третьем отсеках). Суммарная совокупная мощность всей станции в пиковом состоянии составляет 10580 кВт/ч. Рабочий двигатель электрический, возбуждается постоянными магнитами. Марка СЭД-1, удельная мощность 4100 кВт.

Выбранная мощность двигателя и емкость аккумуляторов не случайны. Дело в том, что именно при таком соотношении становится возможным ускорение заряжания батарей, что почти вдвое увеличивает нахождение ПЛ на перископной глубине. Поскольку в генераторе отсутствует щеточный коллектор, обслуживание и эксплуатация всей установки значительно упрощается и становится намного безопаснее. В этом отношении «Лада» — лодка, во многом опередившая свое время.

Принципиальная схема работы двигателей

Всережимный электродвигатель выполняет роль главного движителя во всех походных режимах корабля. В принципе, мы уже говорили о том, что движение на одном только дизеле не предусмотрено в принципе. Винт имеет семь лопастей, он изготовлен по специальной, малошумной технологии. Такое положение вещей во многом было достигнуто благодаря саблевидной форме лопастей, дающей минимальный уровень шума при езде. Кроме того, на подводной лодке установлены две выносные рулевые колонки марки РДК-35.

Максимально достижимая скорость в надводном положении достигает 21 узла. В подводном положении подводная лодка не развивает скорость более 10 узлов. Запас хода около 6000 миль, но при езде на экономичной скорости можно увеличить ресурс еще на 650 миль.

Об условиях жизни и труда экипажа судна

Экипаж состоит из 35 человек. Для спасения людей в случае ЧС предусмотрена система спасения КСУ-600. Предполагает дистанционный автоматический выпуск спасательных плотов модели ПСНЛ-20. Всего их два, они расположены в надстройке для выдвижных устройств.

Жилая зона на подводной лодке находится в третьем отсеке. В отличие от надводных кораблей СССР и РФ для экипажа созданы очень хорошие бытовые условия. Для персонала предусмотрены двухместные каюты. Каждому офицеру отведена отдельная комната.

Прием пищи происходит в кают-компании, совмещенной с кладовой. Запасы продуктов в зависимости от их характеристик и требований к хранению размещают в охлаждаемых и неохлаждаемых кладовых. В последние годы на подводных лодках этой серии стали устанавливать камбузное оборудование нового типа: при очень компактных размерах оно обеспечивает приготовление полного и разнообразного пищевого пайка для экипажа.

Запасы пресной воды хранятся в цистернах из пищевой нержавеющей стали. Пополнить запас продовольственной пресной воды можно прямо в поле. Для этого предусмотрены опреснительные установки, которые используют для работы тепло от работающих дизелей. В целом при регулярном течении похода запасов воды достаточно для обеспечения не только бытовых, но и технических нужд. Полностью загруженная всем необходимым субмарина остается автономной в течение 45 суток.

Дальнейшая эксплуатация и перспективы корабля

Как это часто бывает, подводная лодка «Лада» не выдержала испытания временем. Дело в том, что его технические характеристики не соответствуют современным требованиям, которые предъявляются к судам такого класса. Так, на данный момент идет интенсивная работа по созданию анаэробных электростанций. В конце 2012 года Индия, давний стратегический партнер нашей страны, изъявила желание приобрести шесть таких лодок проекта 677 «Лада».

Проще говоря, стране нужны такие ДЭПЛ, которые могли бы находиться в боевых походах как можно дольше, без необходимости подниматься даже на перископную глубину. Подлодка «Лада», воздухонезависимая энергетическая установка которой будет усовершенствована, сможет много месяцев «плавать». Следует отметить, что научные исследования в этом направлении ведутся достаточно успешно.

Что нового?

Нововведений в конструкцию хорошо зарекомендовавшего себя корабля будет внесено немало. Разработчик — известное предприятие ЦКБ МТ «Рубин». В середине 2013 года было окончательно принято решение, что подводная лодка «Лада» продолжит нести службу в ВМФ России. В модернизированном, разумеется, варианте.

Большое внимание российские специалисты уделяли модернизации бортовых электронных систем. Была полностью переосмыслена автоматика торпедной установки, практически полностью переработана (с учетом использования современных технологий) механика электросиловой установки.

Не осталась без внимания и навигация: учитывая, сколько новых решений в нее было заложено, можно смело сказать, что эта система воссоздана заново. Неудивительно, что такая подводная лодка «Лада» неизбежно привлекает внимание зарубежных заказчиков.

Первым со стапелей сойдет Кронштадт. Как ни странно, бывшие «старушки», которые готовились к полному списанию, сегодня входят в число самых совершенных неатомных подводных лодок в мире. Можно с уверенностью сказать, что при сохранении темпов работ ими с удовольствием воспользуется не только российский флот, но и многие иностранные заказчики, поддерживающие бюджет страны.

Однако сколько катеров проекта 677 «Лада» на сегодняшний день нужно России, так как эти корабли являются прекрасным средством охраны морских границ и побережий, которых у нашей страны предостаточно.

Биосенсоры | Бесплатный полнотекстовый | Разработка ДНК-биосенсора на основе флуоресцентно-резонансного переноса энергии (FRET) для обнаружения синтетического олигонуклеотида Ganoderma boninense

1.

Введение

Пальмовое масло стало важным источником растительного масла в Азии, особенно в Малайзии и Индонезии. Этот ценный ресурс сталкивается с серьезной проблемой инфекции, называемой базальной гнилью стебля (BSR), вызываемой видом, известным как Ganoderma boninense [1]. Если его не обнаружить на ранней стадии, растения погибнут; никакое известное лечение не может спасти растения после появления симптомов. BSR вызывает появление плодовых тел у основания стебля, нераспустившиеся побеги, пожелтение кроны и глубокие трещины у основания стебля [2].

В последнее время большой интерес исследователей вызывают исследования наночастиц как сенсоров для диагностики и выявления заболеваний. Сообщалось, что квантовая точка (КТ) способна преодолеть ограничения органических красителей. КТ — это полупроводник (CdSe, CdS, CdTe) с диаметром от 2 до 10 нм, который имеет преимущества в оптических приложениях. КТ обладают уникальными свойствами, такими как широкая полоса поглощения и узкая полоса излучения, что идеально подходит для одновременного обнаружения нескольких флуорофоров [3]. Кроме того, КТ устойчивы к фотообесцвечиванию, перестраиваются по размеру и обладают высокой чувствительностью для обнаружения биомолекул (ДНК, белков, пептидов), выступая в качестве люминесцентных зондов в биологических системах [4]. Чтобы сделать КТ совместимыми и гибкими, гидрофобная поверхность КТ должна быть модифицирована, чтобы иметь гидрофильную функциональную группу. Эта же функциональная группа может быть использована для конъюгации с биомолекулами в водной среде [5].

При анализе биологического применения, связанного с КТ, он служит донором энергии в системе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET). FRET определяется как пространственное диполярное взаимодействие, которое позволяет передавать электронную энергию от донора к акцептору [6]. КТ имеют широкий диапазон поглощения и могут возбуждаться вдали от области возбуждения молекулы-акцептора, а спектр поглощения акцептора может быть сопряжен с узким излучением КТ. Используя эту систему, можно обнаружить специфическую ДНК-мишень, где FRET можно использовать в качестве сигнала для обнаружения положительной гибридизации.

В этом отчете мы применили основанный на FRET метод с использованием квантовых точек для обнаружения синтетической ДНК Ganoderma boninense. В нашем подходе синтезированные КТ химически модифицируют для связывания с ДНК-зондом. В качестве акцептора в системе FRET используется меченный Cy5 репортерный зонд, комплементарный половине ДНК-мишени. Сигнал FRET, который можно наблюдать после гибридизации с ДНК-мишенью, может быть маркером существования Ganoderma boninense.

2. Экспериментальная часть

2.1. Материал

Химические вещества, включая октадецен, триоктилфосфин, порошок селена, толуол и 3-меркаптопропионовую кислоту (МФК, 99%), были приобретены у Sigma-Aldrich. Гидрохлорид 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида (EDC, ≥98%) и N-гидроксисукцинимид (NHS, ≥98,5%) были приобретены у Fluka. Гидроксид калия (KOH) был приобретен у Systerm. Ацетон и этанол были приобретены у HmBG. Метанол был приобретен у J.T.Baker (Center Valley, PA, USA).

Все ДНК были приобретены в First BASE Laboratories Sdn Bhd, Селангор (Селангор, Малайзия), и их последовательности следующие:

Зонд ДНК-амино модифицированная одноцепочечная ДНК (оцДНК) (20-мер):

Комплементарная ДНК-мишень (35-мер):
Некомплементарная ДНК (35-мер):
Репортерный зонд (15-мерный):

Все олигонуклеотиды (100 мкМ) разбавляли буфером ТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) перед использованием в качестве маточных растворов и хранили в замороженном состоянии. Другие приготовленные растворы представляли собой фосфатно-солевой буфер (PBS) (137 мМ NaCl, 10 мМ фосфат, 2,7 мМ KCl) (pH 7,4), бикарбонатно-натриевый буфер (NaHCO 9).0133 3 ) (50 мМ, рН 9,0) и фосфатный буфер (20 мМ, рН 6,0).

2.

2. Метод

2.2.1. Приготовление CdSe QD

Тридцать мг Se, 5 мл октадецена и 0,4 мл триоктилфосфина добавляли вместе в круглодонную колбу на 10 мл. Раствор перемешивали и при необходимости нагревали до полного растворения Se. 13 мг CdO добавляли в круглодонную колбу на 25 мл, зажатую в колбонагревателе. Затем в ту же колбу добавляли 0,6 мл олеиновой кислоты и 10 мл октадецена. Колбу встряхивали, чтобы смешать жидкости. Затем раствор смеси кадмия нагревали до 225°C. Чистой и сухой пипеткой быстро переносили 1 мл раствора смеси селена при комнатной температуре в раствор смеси кадмия.

2.2.2. Приготовление водорастворимых КТ CdSe

Водорастворимые КТ CdSe были приготовлены с использованием метода реакции лигандного обмена, при котором 500 мкл КТ CdSe в толуоле реагировали со 100 мкл МФК. Смесь накрывали алюминиевой фольгой и хранили в холодильнике в течение ночи. По истечении этого времени инкубации в смесь переносили 1 мл 1,0 М КОН и формировали два фазовых слоя, а верхний слой отбрасывали. Затем к оставшейся фазе добавляли 1 мл толуола. Верхний слой полученной эмульсии также отбрасывали. Далее проводили процесс осаждения для удаления избытка МФК добавлением к раствору 1 мл ацетона в течение трех повторных циклов. Затем полученный осадок растворяли в 1 мл фосфатного буферного раствора (PBS) и хранили в виде исходного раствора в холодильнике для дальнейшего использования.

2.2.3. Присоединение КТ CdSe к оцДНК (конъюгат CdSe КТ-оцДНК)

Смесь 200 мкл 1:1 (об./об.) EtOH/H ₂ O использовалась для растворения 30 мг EDC и 15 мг NHS, которые были затем переносили в 200 мкл фосфатного буфера (20 мМ, рН 6,0). Затем к смеси добавляли 200 мкл смеси 1:1 (об./об.) CdSe QD/H ₂ O. Раствор обрабатывали ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 1 мин, а затем оставляли на 1 ч при комнатной температуре. Затем раствор центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин и удаляли прозрачный супернатант. Осадок тщательно промывали водой (2 х 200 мкл). Затем 175 мкл 1:1 (об./об.) MeOH/H 9Смесь 0133 2 O добавляли к осадку, затем добавляли 25 мкл ДНК, модифицированной амином C6 (440 мкМ), и 100 мкл буфера NaHCO ₃ (50 мМ, рН 9,0). Раствор смеси обрабатывали ультразвуком в течение 2 минут, чтобы разрушить осадок, и раствор хранили при 4°C в течение ночи. После этого времени реакции образец центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 минут, и прозрачный супернатант осторожно отделяли от осадка. Осадок промывали 200 мкл MeOH/H ₂ O в соотношении 1:1 (об./об.) перед добавлением 0,5 мл деионизированной воды и обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин для получения прозрачного маточного раствора. Его хранили в темноте при температуре 4 °С до дальнейшего использования.

2.2.4. Гибридизация

Гибридизационный раствор объемом 1500 мкл, содержащий рассчитанное количество конъюгата CdSe QD-ssDNA, репортерный зонд, ДНК-мишень и буфер PBS, смешивали в пробирке Эппендорфа и тщательно встряхивали для получения гомогенного раствора. Гибридизацию проводили в течение 2 ч при комнатной температуре до регистрации флуоресцентной эмиссии.

2.2.5. Флуоресцентное излучение

Образец переносили в кварцевую кювету с помощью микропипетки. Измерение флуоресценции для всех образцов проводили с использованием спектрофлуорофотометра (Shimadzu RF-5301PC, Киото, Япония). Для получения спектров излучения (диапазон 500–800 нм) всех образцов использовали фиксированную длину волны возбуждения 488 нм со скоростью сканирования 2 нм/с, полосой пропускания 4 нм и шириной скольжения 10 нм.

2.2.6. Трансмиссионная электронная микроскопия (ПЭМ)

Размер частиц образцов измеряли с использованием прибора HITACHI H-7100 TEM. Образцы водорастворимых КТ CdSe и конъюгата КТ CdSe-оцДНК наносили на медную сетку отдельно для сушки и распределения. Затем образцы измеряли с увеличением 200 000× в масштабе 100 нм.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Водорастворимый CdSe QD

Водорастворимый CdSe QD реагировал с МФК в течение ночи, чтобы убедиться, что гидрофобные лиганды, гексадециламин (HDA) и триоктилфосфин (TOPO) были заменены карбоксильными (COOH) функциональными группами MPA с использованием метода реакции лигандного обмена. В этой реакции гидрофобные лиганды вокруг поверхности КТ CdSe были заменены гидрофильными лигандами, которые содержат тиоловые функциональные группы, которые присоединены к поверхности КТ, что приводит к удалению групп СООН от КТ. Приготовленные водорастворимые КТ CdSe стабильны до одной недели.

Метод реакции лигандного обмена, использованный в этом исследовании, позволил эффективно заменить TOPO и HDA тиолами из MPA. Наличие карбоксильных групп важно для повышения растворимости КТ в воде. В процессе реакции лигандного обмена новые лиганды должны иметь как можно более сильное сродство к КТ, достаточное для того, чтобы быстро и эффективно заменить исходные молекулы ПАВ. В этом исследовании тиоловые группы сильно связываются с поверхностью КТ CdSe, заменяя более слабую связь гидрофобного поверхностно-активного вещества TOPO и HDA. В принципе, при взаимодействии МФК с КТ CdSe значение ее рН снижается до определенного значения, при котором ТОРО и ГДА протонируются и отщепляются от КТ CdSe [7]. Сильное сродство тиолированных групп повысит способность связывания гидрофильных лигандов с поверхностью КТ CdSe.

Обычно КТ наночастиц модифицировали для биоконъюгации и улучшения оптических свойств. Поскольку органический лиганд несовместим в водном состоянии, введение СООН-групп повышает способность КТ ковалентно реагировать с ДНК в водной среде и повышает ее растворимость в воде. Кроме того, покрытие защищает КТ от фотоинициируемой деградации поверхности, которая напрямую связана с ослаблением интенсивности флуоресценции и токсичностью.

3.2. Активация функциональной группы COOH на КТ CdSe с помощью EDC и NHS

Водорастворимые КТ CdSe, содержащие СООН-группы в качестве бифункциональных лигандов, смешивали с активаторами, EDC и NHS для образования конъюгата КТ-оцДНК через амидные связи. Обычно NHS использовали для получения аминореакционноспособных сложных эфиров групп СООН для химической маркировки, сшивания и твердофазной иммобилизации. В этой реакции EDC реагировал с COOH-группами CdSe QD с образованием нестабильного амино-реакционноспособного промежуточного соединения O-ациломочевины, которое также подвержено гидролизу, что делает его нестабильным и недолговечным в водном растворе. Это промежуточное соединение стабилизировали добавлением NHS с образованием полустабильного аминореакционноспособного сложного эфира NHS. Затем группы СООН полученного промежуточного соединения реагировали с NH ₂ группа зонда одноцепочечной ДНК с концевой аминогруппой для образования стабильной амидной связи и обеспечения возможности конъюгации квантовых точек CdSe с одноцепочечной ДНК.

3.3. Характеристика восприятия на основе эмиссии флуоресценции

Изменения сигналов флуоресценции для конъюгата CdSe QD-оцДНК и гибридной системы, содержащей ДНК-мишени (комплементарную и некомплементарную ДНК), были использованы для характеристики сенсорной способности разработанной системы обнаружения. На рис. 1 показаны спектры флуоресценции CdSe QD-ssDNA и CdSe QD-dsDNA, гибридизованных с комплементарной и некомплементарной ДНК-мишенью. Для всех спектров получен пик излучения при 640 нм, соответствующий излучению КТ. Только гибридизация с комплементарной ДНК-мишенью показывает пик эмиссии при 680 нм, что подтверждает наличие гибридизации.

Раствор для гибридизации содержит два зонда; репортерный зонд, меченный Cy5 и одноцепочечной ДНК, конъюгированной с QD. При гибридизации с ДНК-мишенью репортерный зонд и КТ-оцДНК CdSe будут связываться с мишенью, образуя сэндвич-гибрид [8]. Гибридизация происходит в этой системе, поскольку последовательности оцДНК и репортерного зонда полностью совпадают с последовательностью ДНК-мишени (оцДНК соответствует одной половине целевой последовательности, а репортерный зонд соответствует другой половине мишени). Возникающее в результате взаимодействие гибрида сближает акцепторную, Су5 и донорную КТ. При возбуждении на длине волны 488 нм КТ испускают излучение на длине волны 640 нм и опережают излучение флуоресценции от акцептора Cy5 посредством освещения FRET, как показано на рисунке 2.9.0003

Рисунок 1. Спектры флуоресценции ( a ) CdSe квантовая точка (КТ)-оцДНК, ( b ) CdSe QD-оцДНК, гибридизованная с комплементарной ДНК, и ( c ) CdSe QD-оцДНК, гибридизованная с некомплементарной ДНК; Возбуждение фиксировали на 488 нм; скорость сканирования: 2 нм/с; ширина скольжения: 10 нм.

Рисунок 1. Спектры флуоресценции ( a ) CdSe квантовая точка (КТ)-оцДНК, ( b ) CdSe КТ-оцДНК, гибридизованная с комплементарной ДНК, и ( c ) CdSe QD-ssДНК, гибридизованная с некомплементарной ДНК; Возбуждение фиксировали на 488 нм; скорость сканирования: 2 нм/с; ширина скольжения: 10 нм.

Рисунок 2. Резонансный перенос энергии флуоресценции между КТ донора и акцептором Cy5.

Таким образом, обнаружение эмиссии флуоресценции от акцептора Су5 указывает на наличие ДНК-мишени и процесс гибридизации, происходивший в растворе. Эмиссия FRET наблюдалась, когда гибридизацию проводили с комплементарной ДНК-мишенью, но эмиссию FRET не наблюдали, когда для гибридизации использовали некомплементарную ДНК-мишень. Это доказало, что система обнаружения способна различать комплементарную и некомплементарную ДНК-мишень. В этом случае некомплементарная ДНК-мишень не гибридизуется с оцДНК и репортерным зондом, и КТ не находится в положении для эмиссии FRET.

3.4. Факторы, влияющие на интенсивность сигнала гибридизации

На рис. A1 (в Приложении) представлены факторы, влияющие на интенсивность сигнала гибридизации. Интенсивность FRET увеличивается по мере увеличения времени гибридизации в диапазоне от 0,5 до 20 мин. Как видно, времени гибридизации в 10 мин достаточно, чтобы получить значительную интенсивность FRET для сенсорных целей. Еще одним важным параметром является влияние температуры. Температура гибридизации всегда обсуждается относительно температуры плавления данного олигонуклеотида. В данном исследовании влияние температуры гибридизации варьировали от 25 до 65 °С. Согласно рисунку A1(B), интенсивность FRET постепенно снижается по мере повышения температуры. Наибольшая интенсивность FRET была получена при проведении гибридизации при 25°C. Гибридизацию ДНК проводили вместе с КТ, конъюгированной с одноцепочечной ДНК, при оптимизированной температуре. Высокая температура повлияет на интенсивность FRET, поскольку КТ потеряют свои фотолюминесцентные (ФЛ) свойства. Флуоресценция уменьшается с повышением температуры. Это связано с увеличением молекулярного движения с повышением температуры, что приводит к большему количеству столкновений молекул и последующей потере энергии [9].]. Чувствительность разработанного ДНК-биосенсора исследовали при различной концентрации ДНК-мишени. График зависимости интенсивности FRET от логарифмической концентрации ДНК-мишени на рисунке A1(B) показывает, что интенсивность FRET уменьшается по отношению к логарифмическому значению концентрации ДНК-мишени. Коэффициент корреляции регрессии (R ² ) равен 0,935, а расчетный предел обнаружения (LOD) для разработанной системы составляет 3,55 × 10 ^-9 М. Уменьшение FRET указывает на увеличение плотности отрицательного заряда за счет образования дуплекс ДНК, который увеличивает электростатические силы отталкивания между КТ и ДНК, что приводит к увеличению расстояния и снижению эффективности [10]. Кроме того, высокая концентрация аналита затруднит прохождение света через образец, чтобы вызвать возбуждение. Таким образом, высокая концентрация аналита будет иметь низкую флуоресценцию, что известно как гашение концентрации [11].

3.5. Характеристика ПЭМ

Размер частиц и морфология водорастворимых КТ CdSe и конъюгата КТ CdSe-оцДНК анализировали с помощью ПЭМ. На рис. 3 показано изображение ПЭМ для обоих образцов в масштабе 100 нм. Видно, что размер частиц находился в диапазоне от 2 до 10 нм. Эти результаты также доказали, что модификация и сопряжение КТ не повлияли на размер ее частиц. Видно, что на рисунке 3(A) наблюдается одна частица КТ, тогда как на рисунке 3(B) наблюдается агломерация, возможно, из-за конъюгации с одноцепочечной ДНК.

Рисунок 3. ПЭМ-изображение водорастворимых КТ CdSe ( A ) и конъюгата КТ CdSe QD-оцДНК ( B ) с увеличением в 200 000 раз.

4.

Выводы

Мы синтезировали КТ CdSe и использовали синтезированные КТ в разработке ДНК-биосенсора для синтетической ДНК Ganoderma boninense. Модификация КТ сохраняет наноразмер КТ и совместима для биоконъюгации с ДНК. FRET с использованием квантовых точек смог подтвердить процесс гибридизации, который позволяет обнаруживать ДНК-мишень Ganoderma boninense с высокой чувствительностью. Разработанная ДНК-биосенсорная система имеет потенциал для быстрого, простого и чувствительного применения в сельскохозяйственном и биологическом анализе.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Министерства науки, технологий и инноваций Малайзии (MOSTI).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Ссылки

Панчал, Г.; Бридж, П.Д. Последующая базальная гниль стебля в молодых посадках масличной пальмы. Микопатология 2005 , 159, 123–127. [Google Scholar] [CrossRef]
«> Бретон Ф.; Хасан, Ю .; Хариади, Л.З.; де Франквиль, Х. Характеристика параметров для разработки раннего скринингового теста на устойчивость к базальной стеблевой гнили у потомства масличной пальмы. Дж. Ойл Пальм Рез. 2006 , 2006, 24–36. [Google Scholar]
Smith, AM; Ни, С. Химический анализ и визуализация клеток с помощью квантовых точек. Аналитик 2004 , 129, 672–677. [Google Scholar] [CrossRef]
Sutherland, A.J. Квантовые точки как люминесцентные зонды в биологических системах. Твердотельный материал. науч. 2002 , 6, 365–370. [Google Scholar] [CrossRef]
Шарма, Х.; Шарма, С.Н.; Кумар, У .; Сингх, В. Н.; Мехта, Б.Р.; Сингх, Г.; Шивапрасад, С.М.; Каккар, Р. Формирование водорастворимых и биосовместимых квантовых точек CdSe, покрытых TOPO, с эффективной фотолюминесценцией. Дж. Матер. науч. Матер. Мед. 2008 , 20, 123–130. [Google Scholar]
Algar, W. R.; Крулл, Ю.Дж. Квантовые точки как доноры при резонансном переносе энергии флуоресценции для биоанализа нуклеиновых кислот, белков и других биологических молекул. Анальный. Биоанал. хим. 2008 , 391, 1609–1618. [Google Scholar] [CrossRef]
Алдана, Дж.; Лавель, Н.; Ван, Ю.; Пэн, X. Зависимый от размера pH диссоциации тиолатных лигандов из нанокристаллов халькогенида кадмия. Варенье. хим. соц. 2005 , 127, 2496–2504. [Google Scholar] [CrossRef]
Zhang, CY; Да, ХК; Куроки, МТ; Ван, Т.Х. Наносенсор ДНК на основе одиночных квантовых точек. Нац. Матер. 2005 , 4, 826–831. [Google Scholar] [CrossRef]
Guilbault, G.G. Практическая флуоресценция; Издательство Taylor & Francis: Нью-Йорк, США, 1990; стр. 28–29. [Google Scholar]
Пэн Х.; Чжан, Л.; Кьяллман, Т.Х.М.; Соллер, К.; Травас-Сейдик, Дж. Обнаружение гибридизации ДНК с помощью синих люминесцентных квантовых точек и одноцепочечной ДНК, меченной красителем. Являюсь. хим. соц. 2007 , 129, 1–2. [Google Scholar]
Техническое примечание: Введение в измерение флуоресценции. Доступно в Интернете: http://www.turnerdesigns.com/t2/doc/appnotes/998-0050.pdf (по состоянию на 25 сентября 2012 г.).
Кристиан, Г. Д. Аналитическая химия; Джон Уайли и сыновья: Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США, 2004 г.; п. 113. [Google Scholar]

Приложение

Рисунок A1. Факторы, влияющие на интенсивность сигнала гибридизации; влияние ( A ) времени гибридизации ( B ) температура гибридизации и ( C ) концентрация ДНК-мишени при эмиссии FRET. Возбуждение фиксировали на 488 нм; скорость сканирования: 2 нм/с; ширина скольжения: 10 нм.

Рисунок A1. Факторы, влияющие на интенсивность сигнала гибридизации; Влияние ( A ) времени гибридизации ( B ) температуры гибридизации и ( C ) концентрации ДНК-мишени на эмиссию FRET.