Содержание

Подводные лодки проекта 677 «Лада»

Подводные лодки проекта 677 (шифр «Лада») — серия российских дизель-электрических подводных лодок, разработанных в конце XX века в ЦКБ «Рубин». Предназначаются для выполнения разведывательных и диверсионных мероприятий против надводных кораблей и подлодок противника, защиты прибрежных районов от вражеских десантов, а также для постановки минных заграждений и прочих подобных задач.

Подводные лодки проекта 677 «Лада» — видео

Таким образом, подводная лодка «Лада», является оптимально подходящей именно для задач современной войны, которая требует максимальной мобильности и незаметности. Особенностью подлодок этой серии является схема их постройки, называемая «полуторной». Дело в том, что корпус (изготовленный из стали АБ-2) имеет одинаковый диаметр по всей длине. В отличие от больших атомных лодок, нос и корма имеют хорошо выраженную сферическую форму. Благодаря переборкам корпус делится на пять независимых отсеков. Палуб на корабле три.

Впечатляющие гидродинамические характеристики обеспечиваются благодаря корпусу специально разработанной, особенно хорошо обтекаемой формы. Выдвижные устройства имеют точно такое же заграждение, которым характеризуются корабли проекта 877, но кормовое оперение сделано крестообразным, а передние рули смонтированы на ограждении. Сделано это для того, дабы они создавали как можно меньше помех при работе гидролокационного оборудования, которым оснащена подводная лодка. Проект «Лада» в этом смысле является настоящим эталоном: она чрезвычайно тихая, ее крайне сложно обнаружить средствами гидролокации и гидроакустики.

Вооружение подлодки проекта 677 «Лада»


Главным средством защиты и нападения являются шесть аппаратов для запуска торпед калибра 533 мм, причем две шахты на верхней палубе предназначены для стрельбы управляемыми боеприпасами. В стандартный боезапас входит 18 торпед. Чаще всего подводная лодка «Лада 677» использует боеприпасы универсального типа (САЭТ-60М, УГСТ), специальные торпеды для уничтожения вражеских подлодок. На борту могут находиться крылатые ракеты, а также 22 мины модели ДМ-1.

Имеется возможность боевого использования противолодочных ракет типа «Шквал». Система ведения огня допускает как одиночные выстрелы, так и залповые стрельбы из шести шахт одновременно. За перезарядку торпедных аппаратов отвечает комплекс «Мурена», который позволяет провести всю операцию в полностью автоматическом режиме. Весь процесс полностью контролируется из командного командирского пункта, которым оборудована подводная лодка. Проект «Лада» был первой в Советском Союзе разработкой неатомного подводного корабля, в котором бы использовалось такое количество сложной и высокоэффективной автоматики.

Чтобы обеспечить защиту лодки от боевой авиации противника, экипаж может воспользоваться шестью ПЗРК модели «Игла-1М». Координация работы всех боевых систем обеспечивается посредством использования системы «Литий». Таким образом, подводная лодка «Лада», вооружение которой мы расписали, при своих небольших габаритах способа доставить большие проблемы любому противнику.

Гидролокационный комплекс

За гидролокационную разведку отвечает комплекс «Лира», в состав которого входят мощные чувствительные антенны. В состав установки входит сразу три антенны, одна из которых расположена на носу подводной лодки, а две – смонтированы по ее бокам. Инженеры максимально увеличили их диаметр ради точности измерения подводных шумов. Так, передняя антенна занимает едва ли не все пространство на носу подлодки. На случай повреждения бортового оборудования имеется выпускаемая гидролокационная аппаратура, которую подводная лодка «Лада» (проект 677) может буксировать за собой на марше.

Система навигации

Навигационная система – инерциального типа. Отвечает за предоставление данных о точном месторасположении корабля, а также за определение той оптимальной скорости, при которой имеющееся на борту вооружение может быть использовано с максимальной эффективностью.

В составе системы имеется перископное оборудование типа УПК «Парус-98», в состав которого входят следующие элементы:

  • Непроникающий перископ командирский, «Парус-98КП». Имеет дневной и низкоуровневый каналы (оптический и ТВ). Степень увеличения варьируется от 1,5 до 12Х, есть возможность видеозаписи наблюдаемых данных.
  • Мачта оптронная, непроникающего типа «Парус-98УП». Фактически является многофункциональным универсальным перископом. В составе конструкции – два канала (дневной и низкоуровневый), степень увеличения – как у командирского телескопа, имеется высокоэффективный лазерный дальномер.

Таким образом, подводная лодка «Лада», ТТХ которой мы вкратце расписали, может с равным успехом использоваться в дневных и ночных условиях. Она всегда оставаясь незаметной для противника.

Прочие элементы навигационной системы

Важнейшим элементом является радиолокационная система модели РЛС КРМ-66 «Кодак». Включает в свой состав активный и пассивный радиоканалы, может работать в совмещенном режиме. При активном использовании может быть активирован особо защищенный, скрытый канал связи. Он дает полную картину окружающей подлодку обстановки (в том числе и надводной), но при этом никак не демаскирует корабль. В этом смысле подводная лодка «Лада» (проект 677) является во многом уникальным объектом, аналогов которого в мире действительно нет, как бы избито не звучало данное выражение.

Цифровая система связи модели «Дистанция». Позволяет обмениваться информацией по двунаправленному защищенному каналу передачи информации с береговыми командными пунктами, кораблями и самолетами (при условии нахождения на перископной глубине). Если возникает необходимость отправить экстренно важное сообщение с большой глубины, используется выпускная буксируемая антенна. Это оборудование находится в особо прочном корпусе, способном защитить его даже в случае боевых действий. Проще говоря, «Лада» — лодка весьма живучая.

Наконец, комплекс навигационного оборудования «Аппассионата». Содержит систему навигации инерциального типа, а также модуль спутниковой навигации GPS/ГЛОНАСС. Точность определения местонахождения при его использовании чрезвычайно велика, но зависит от близости расположения базовой станции корректировки для того или иного «провайдера».

Силовая установка

«Сердцем» подлодки является дизель-электрическая силовая установка, выполненная по схеме, которая предусматривает движение исключительно на электрическом ходу. Этим и отличается от зарубежных аналогов подводная лодка «Лада». ТТС (транспортно-технические системы) зарубежных кораблей этого класса могут обеспечивать движение только на дизельном двигателе.

Дизельный двигатель располагается в четвертом отсеке. Для выработки электричества служат два генератора марки 28ДГ, сопряженные с выпрямителями мощностью по 1000 кВт каждый. Энергия запасается в двух группах аккумуляторных батарей. В каждой из них находится 126 элементов (они находятся в первом и третьем отсеках). Общая совокупная мощность всей установки в пиковом состоянии — 10580 кВт/ч. Рабочий двигатель – электрический, возбуждается постоянными магнитами. Марка СЭД-1, удельная мощность равна 4100 кВт.

Выбранная мощность двигателя и емкость аккумуляторных батарей не случайны. Дело в том, что именно при таком соотношении становится возможной ускоренная загрузка батарей, которая практически в два раза сокращает нахождение подлодки на перископной глубине. Так как в составе генератора нет щеточного токосъемного устройства, обслуживание и эксплуатация всей установки резко упрощается и становится намного безопаснее. В этом отношении «Лада» — лодка, во многом опередившая свое время.

Основная схема работы двигателей

Всережимная электрическая силовая установка исполняет роль главного движителя во всех походных состояниях корабля. В принципе, мы уже говорили о том, что движения на одном только дизельном ходе не предусмотрено в принципе. Гребной винт имеет семь лопастей, выполнен по особой, малошумной технологии. Такое положение вещей во многом было достигнуто благодаря саблевидной форме лопастей, которая выдает минимальный уровень шума при движении. Кроме того, подлодка имеет две выносных рулевых колонки марки РДК-35.

Максимально достижимая скорость в надводном положении достигает 21 узла. В подводном положении подлодка не разгоняется свыше 10 узлов. Дальность плавания составляет порядка 6000 миль, но при движении экономичным ходом можно увеличить ресурс приблизительно еще на 650 миль.

Об условиях жизни и работы экипажа судна

В состав экипажа входит 35 человек. Для спасения людей в случае ЧП предусмотрена спасательная система КСУ-600. Она предполагает дистанционный автоматический выпуск спасательных плотов модели ПСНЛ-20. Всего их две штуки, они расположены в надстройке для выдвижных устройств. Жилая зона на подлодке располагается в третьем отсеке. В отличие от надводных кораблей СССР и РФ, для экипажа созданы весьма неплохие условия проживания. Для личного состава предназначены двухместные каюты. Каждому офицеру положено отдельное помещение.

Прием пищи происходит в кают-компании, совмещенной с буфетной комнатой. Запасы пищи, в зависимости от их характеристик и требований к хранению, располагаются в охлаждаемых и неохлаждаемых кладовых. В последние годы на подлодки этой серии стали устанавливать камбузное оборудование нового образца: при весьма компактных размерах оно обеспечивает приготовление полноценного и разнообразного пищевого довольствия экипажа.

Запасы пресной воды хранятся в цистернах из пищевой нержавеющей стали. Пополнить запас пищевой пресной воды можно прямо в походных условиях. Для этой цели предусмотрены опреснительные установки, которые для работы используют тепло от работающих дизельных двигателей. В общем и целом, при штатном протекании похода запасов воды вполне достаточно для обеспечения не только бытовых, но и технических нужд. Полностью загруженная всем необходимым подлодка остается автономной на протяжении 45 суток.

Что нового?

Нововведений в конструкцию хорошо себя зарекомендовавшего корабля будет внесено немало. Разработчиком выступает знаменитое предприятие ЦКБ МТ «Рубин». В середине 2013 года было окончательно решено, что подводная лодка «Лада» продолжит стоять на вооружении ВМФ РФ. В модернизированном, конечно же, варианте. Большое внимание отечественные специалисты уделили модернизации бортовых электронных систем. Была полностью переосмыслена автоматика торпедной установки, практически полностью переделана (с учетом использования современных технологий) механика электрической силовой установки. Не осталась «обойденной» и навигация: учитывая, сколько новых решений было в нее заложено, можно смело говорить о том, что эта система заново создана. Неудивительно, что такая подводная лодка «Лада» неминуемо привлекает внимание иностранных заказчиков.

На сегодняшний день субмарины проекта 677 «Лада» стали одними из наиболее совершенных неатомных подводных лодок во всем мире. Можно с уверенностью говорить о том, что при условии сохранения темпов работ их с удовольствием будет приобретать не только отечественный ВМФ, но и многие иностранные заказчики, поддерживая бюджет страны.

Модификации

«Амур-950» — экспортная модификация проекта 677 «Лада» оснащена четырьмя торпедными аппаратами и УВП на десять ракет, способна произвести залп из десяти ракет за две минуты. Экипаж — 18 (по другим данным 21) человек. Автономность — 30 суток. Глубина погружения — 250 метров.

«Амур-1650» — ещё одна экспортная модификация. Имеет шумопеленгаторную антенну, способную обнаруживать особо малошумные цели, может дать залп из шести ракет.

Представители

Б-585 «Санкт-Петербург» — находится в опытной эксплуатации до 2016 года

Б-586 «Кронштадт» — до середины 2012 года строительство было заморожено и возобновлено только 09.07.2013

Б-587 «Великие Луки» — лодка была перезаложена 19 марта 2015 года

Тактико-технические характеристики подводных лодок 677 «Лада»

Тип корабля……………..многоцелевая ДЭПЛ
Скорость (надводная)……………..10 узлов
Скорость (подводная)……………..21 узел
Рабочая глубина погружения. …………….250 м
Предельная глубина погружения……………..00 м
Автономность плавания……………..45 (30 для «Амур-950») суток
Экипаж……………..35 (21 для «Амур-950») человек
Водоизмещение надводное……………..1 765 (1 150) т
Водоизмещение подводное……………..н/д
Длина наибольшая (по КВЛ)……………..66,8 (58,8) м
Ширина корпуса наиб………………7,1 (5,65) м
Силовая установка ГЭУ с полным электродвижением…….ДГ с двигателями Д49; ВНЭУ на ТЭ (в перспективе)
Торпедно-минное вооружение…….6 ТА калибра 533 мм, 18 (16) торпед УСЭТ-80К, до 44 мин
Ракетное вооружение……УВП на 10 ракет РК П-800 «Оникс» и/или «Калибр»
ПВО……………..ПУ ПЗРК «Игла-1М», 6 ЗУР в ТПК

Подводная лодка проекта 677 «Лада» — фото с парада в Санкт-Петербурге

Японский линкор «Ямато» — самый большой в мире

Адмирал Кузнецов — тяжёлый авианесущий крейсер (ТАВКР) проекта 1143. 5

Крейсер «Петр Великий» проект 1144 «Орлан» флагман Северного флота

Варяг — бронепалубный крейсер Российского Императорского флота

Подводные лодки проекта 941 «Акула» — самые большие в мире

Аскольд — бронепалубный крейсер Российского императорского флота

Подводные лодки проекта 955 «Борей»

Немецкий линкор «Бисмарк» — корабль Второй мировой войны

Фото АПЛ РФ (21 фото)

Ракетный крейсер «Москва» (Слава) — флагман Черноморского флота России

Худ — британский линейный крейсер Второй мировой войны

Ляонин (бывший Варяг) — первый авианосец Китая

Французские линкоры типа «Ришелье» Второй мировой войны

Проект 1143 «Кречет» — тяжелые авианесущие крейсеры

Подводные лодки проекта 636 «Варшавянка»

Проект 971 «Щука-Б» — атомные подводные лодки

Корабельная установка АК-630. Дальность стрельбы. Скорострельность

Джеральд Р. Форд — авианосец США

Эскадренный миноносец «Настойчивый» — флагман Балтийского флота

Ракетный крейсер «Варяг» (Червона Украина) — флагман Тихоокеанского флота России

Проект 11351 «Нерей» (Тип «Менжинский») — сторожевые корабли погранвойск

Линкор «Октябрьская Революция» («Гангут»)

Сверхмалые подводные лодки проекта 865 «Пиранья»

Проект 1234 шифр «Овод» малые ракетные корабли

Подводные лодки проекта 677 «Лада»

Громобой — броненосный крейсер российского императорского флота

ССВ-33 «Урал» — корабль радиоэлектронной разведки проекта 1941 шифр «Титан»

БДК типа «Иван Рогов» — большой десантный корабль

«Бора» и «Самум» — малые ракетные катера на воздушной подушке

Затонувшие корабли

Акаги — японский авианосец Второй мировой войны

Проект 641Б «Сом» — дизель-электрическая подводная лодка

Фото американских авианосцев. Подборка

Проект 1135 «Буревестник» (тип «Бдительный») — сторожевые корабли

Гнейзенау — германский линкор тип «Шарнхорст»

Проект 1135М «Буревестник» (тип «Резвый») — сторожевые корабли

Мистраль — десантные корабли-вертолетоносцы

Россия — броненосный крейсер российского императорского флота

Рональд Рейган — авианосец США

Проект 11540 «Ястреб» (Тип «Неустрашимый») — сторожевые корабли (фрегаты)

«Императрица Мария» — русский линкор Первой мировой войны

Линкор «Фусо» — линейный корабль ВМС Японии 1915-1944 год

Джордж Буш — авианосец США

«Дельфин» — первая российская подводная лодка

«Адмирал граф Шпее» — германский линкор Второй мировой войны

Американские линкоры типа «Айова» Второй мировой войны

Пересвет — броненосец российского императорского флота

АПКР К-18 «Карелия» — атомный подводный ракетный крейсер

КИК «Маршал Крылов» — корабль измерительного комплекса проекта 1914. 1

«Литторио» — итальянский линкор Второй мировой войны

Шарль де Голль — авианосец ВМС Франции

Английский линкор «Родни» тип «Нельсон» Второй мировой войны

«Дюнкерк» — французский линкор Второй мировой войны

Линкор «Ямасиро» — линейный корабль Японии 1917-1944 год

Японские линкоры типа «Исэ» Второй мировой войны

Космонавт Юрий Гагарин — научно-исследовательское судно

Дизель-электрические подлодки проекта 633

АК-726 — корабельная 76-мм артустановка

Подрыв и затопление авианосца списанного в утиль

Подводные лодки типа «Касатка»

«Альбион» — десантно-вертолётный корабль-док ВМС Великобритании

Адмирал Ушаков — русский броненосец

Кета — подводная лодка

Форель — подводная лодка

Тип «Сом» — подводные лодки 1904 — 1906 годов

Подводные лодки тип «Карп»

Тип «Осётр» — подводные лодки

Добавить комментарий

Проект 677 — дизельные подводные лодки Лада, история разработки и представители, конструкция и вооружение, характеристики, достоинства и недостатки

Спуск на воду подводной лодки проекта 677 «Кронштадт»

Несмотря на то, что в составе флотов разных стран мира присутствует немало подводных лодок с ядерным реактором на борту, военные моряки не спешат отказываться от дизель-электрических субмарин. Лидерами по созданию подобных кораблей долгие годы были СССР и ФРГ. Россия, к сожалению, во многом утратила былые позиции, о чем свидетельствует, в частности, долгая и мучительная история разработки подводных лодок проекта 677 «Лада». Проектирование их началось еще в советские годы, но только сейчас дело дошло до серийного изготовления. В скором будущем «Лады» могут усилить ВМФ, однако их так и не удалось наделить теми качествами, к достижению которых когда-то стремились конструкторы.

Содержание

История создания

Чуть более тридцати лет тому назад, в 1988 году, в состав военно-морского флота Швеции была введена подводная лодка, снабженная, наряду с традиционными дизелями, особым вспомогательным двигателем. Это была так называемая анаэробная силовая установка. Её основное отличие – это способность работать без использования атмосферного воздуха. Такая особенность позволяет субмаринам, не имеющим на борту атомного реактора, проводить в подводном положении до двадцати дней, что радикально повышает скрытность.

В  СССР подлодки с силовыми установками подобного типа, «двигателями Стирлинга», создавались еще в 50-е годы прошлого века, однако их практическое использование оказалось крайне опасным из-за технических трудностей, связанных с необходимостью хранения на борту жидкого кислорода. Тем не менее после появления новых шведских субмарин стало понятно, что старую идею необходимо обдумать на новом уровне.

Неатомная немецкая подводная лодка типа 212А с воздухонезависимой энергетической установкой

В последующие годы наличие ВНЭУ (воздухонезависимой энергетической установки) стало ключевым признаком неатомных подводных лодок четвертого поколения. Между тем на вооружении советского, а затем и российского флота продолжали оставаться субмарины с обычными дизельными генераторами и электрическими двигателями.

Чтобы ликвидировать намечающееся отставание, решено было создать отечественную ВНЭУ. Устанавливать её планировалось на большие подлодки проекта 677 (шифр «Лада»), разработка которых началась в 1987-м году. При этом советская анаэробная силовая установка не должна была стать двигателем Стирлинга – речь шла о создании так называемого электрохимического генератора (ЭХГ). Впоследствии по этому пути пошли немецкие конструкторы субмарин, создавшие в итоге в конце двадцатого века вполне удачные неатомные подлодки четвертого поколения проекта 212А.

Ранее в СССР уже производились ЭХГ для космических кораблей, поэтому имелись все основания ожидать успеха. Уровень оптимизма был настолько высоким, что разработку неатомных подводных лодок проекта 677 начали еще до создания ВНЭУ. Это оказалось ошибочным решением.

Первый удар был нанесен в 1991-м году, когда распался Советский Союз. Резкое сокращение всех программ финансирования привело к настоящей деградации проекта 677 и почти полному сворачиванию работ по созданию анаэробного двигателя. Правда, первый корабль новой серии, получивший название «Санкт-Петербург», всё-таки был заложен в 1997-м году, однако его последующее строительство существенно затянулось.

Головная подводная лодка проекта 677 – «Санкт-Петербург»

Трудности во многом были связаны с тем, что руководство конструкторского бюро «Рубин», проектировавшего новую ПЛ, решило пойти по наиболее амбициозному пути – создать двигатель замкнутого цикла без каких-либо выбросов во внешнюю среду и при этом не хранить на борту необходимый для электрохимической реакции водород, а вырабатывать его непосредственно из дизельного топлива. Соответствующий процесс называется риформингом.

Лодка «Санкт-Петербург» была спущена на воду еще в 2004-м году. Она была оборудована обычными дизель генераторами с перспективой дальнейшего переоснащения на ВНЭУ. Предполагалось, что в дальнейшем субмарины проекта 677 постепенно вытеснят из состава флота «Палтусы» и «Варшавянки» – подводные лодки третьего поколения проектов 877 и 636.

Заводские испытания «Санкт-Петербурга» проходили с 2009-го по 2010-й год, после чего корабль был передан на опытную эксплуатацию в ВМФ России без принятия на вооружение. Сразу же оказалось, что о практическом использовании этой подводной лодки не может идти и речи. В частности, силовая установка могла безопасно работать лишь на 50% от заявленной в документации мощности. Кратковременно тягу можно было увеличивать до 70% от номинала, однако это часто становилось причиной поломок целого ряда деталей, что требовало затем длительного ремонта. Кроме того, неудовлетворительными оказались характеристики боевой информационно-управляющей системы субмарины и её гидроакустического комплекса.

«Санкт-Петербург» во время проведения испытаний в составе ВМФ

Комментируя полученные результаты, главнокомандующий ВМФ России Высоцкий в категоричной форме заявил, что флоту такие подлодки не нужны. Впрочем, затем он пояснил, что сам проект «Лада» остается перспективным – вот только «Санкт-Петербург» так и останется опытным экземпляром для отработки технологий.

Впоследствии, после смены командования ВМФ, финансирование программы по созданию подводных лодок проекта 677 возобновилось. В 2013-м году, в частности, было возобновлено строительство второй субмарины этой серии, получившей название «Кронштадт».

Между тем, разработчиков анаэробной энергетической установки продолжали преследовать неудачи. Представители ЦКБ «Рубин», в разные годы давали довольно противоречивые комментарии о продвижении своего проекта, то обещая в самом скором времени продемонстрировать готовый двигатель должной мощности, то жалуясь на полное прекращение финансирования.

Ситуация с ВНЭУ остается неопределенной и сегодня. Судя по всему, подводные лодки серии 677 так и не получат этой принципиально новой силовой установки. Во всяком случае, её не имеет уже спущенный на воду «Кронштадт», не появится она и на строящейся субмарине «Великие Луки». В соответствии с заявленными планами КБ «Рубин», воздухонезависимыми двигателями будут оснащаться подводные лодки проекта «Калина», однако если это и произойдет, то в довольно далекой перспективе.

Приходится признать, что программа по созданию подводных лодок проекта 677 оказалась явно неудачной. В своем нынешнем виде и «Санкт-Петербург», и «Кронштадт», и «Великие Луки» представляют собой субмарины не четвертого, а третьего поколения, не имеющие ощутимых преимуществ перед старыми «Варшавянками».

Макет энергетического анаэробного модуля для подводных лодок проекта «Калина»

Отставание от иностранных конструкторов было еще в «нулевые» годы  до такой степени очевидным, что встал вопрос о закупке для нужд ВМФ немецких подводных лодок проекта 212А.

Сегодня подобных планов уже нет, однако ситуация остается неопределенной. Если доводка ВНЭУ в ближайшее время не будет завершена, российские создатели неатомных подводных лодок рискуют отстать от своих зарубежных конкурентов не на несколько лет, а навсегда.

Роль дизель-электрических подлодок в ВМФ России

Появление атомных субмарин в свое время рассматривалось многими специалистами как закат эры прежних дизель-электрических лодок. В США их строительство прекратилось еще в конце 50-х годов. Это вполне понятно – ведь американский флот в основном океанский, а не морской. Атомные субмарины как нельзя лучше подходят для длительных подводных переходов – им не нужно «выныривать» и обнаруживать себя.

Между тем для советского, а затем и для российского флота огромное значение имеют действия на ближних и прибрежных коммуникациях, особенно на Балтийском и Черном морях. Для этих условий больше подходят дизель-электрические многоцелевые подлодки России. Они менее шумные, чем атомные, значительно меньше по своим размерам и намного дешевле.

Кроме того, развитие электронного оборудования и ракетного оружия позволяет с успехом применять современные дизель-электрические подводные лодки для уничтожения наземных целей. В частности, как субмарины проекта 677, так и разработанные еще в СССР «Варшавянки» могут осуществлять запуск крылатых ракет большой дальности «Калибр», что заметно повышает их ударный потенциал.

Запуск ракеты «Калибр» из подводного положения

Новые подлодки с воздухонезависимыми двигателями могут в значительной мере превзойти своих атомных соперников даже на океанских коммуникациях, поскольку им уже не требуется «выныривание». Перспективность этого направления неоднократно доказывалась на военно-морских учениях, когда дизель-электрические субмарины успешно «топили» более крупные и шумные лодки с ядерными реакторами на борту.

Особенности конструкции

Одним из главных отличий проекта 677 от подводных лодок «Палтус» и «Варшавянка» стала полуторакорпусная конструкция. При этом лёгкий корпус настолько мал, что иногда «Ладу» называют и однокорпусной. Такое решение привело к уменьшению размеров субмарины и её водоизмещения. При этом удалось дополнительно снизить уровень шума, создаваемого при движении подводной лодки, и её стало намного труднее обнаружить.

Корпус и его компоновка

Прочный корпус подводных лодок проекта 677 изготавливается из специальной стали АБ-2. Его форма близка к цилиндрической, а диаметр почти не изменяется по всей длине. На носу и корме имеются полусферические оконцовки. На рубке установлены передние рули глубины, а на корме – задние, образующие вместе с рулем поворота своеобразный «крест». В целом управляющие поверхности размещены таким образом, чтобы не мешать работе гидроакустического комплекса.

Корпус разделен на отдельные помещения поперечными переборками и продольными платформами.

Схема компоновки подводной лодки проекта 677

Перечень отсеков таков:

  1. Носовой (торпедный отсек). В нем находятся торпедные аппараты, запасной боекомплект и система бесшумного перезаряжания;
  2. Второй отсек. Главное помещение – центральный пост, из которого осуществляется управление подводной лодкой. На нижних ярусах находится часть аккумуляторов и вспомогательные механизмы;
  3. Третий (жилой) отсек. Здесь имеется кают-компания, камбуз, медицинский блок, а также каюты для всех членов экипажа;
  4. Четвёртый отсек. Предназначен для размещения дизель-генераторов;
  5. Пятый отсек. Здесь находится электомотор, приводящий в движение винты подводной лодки.

Благодаря довольно большой кают-компании и наличию спальных мест для каждого из членов экипажа, подводные лодки проекта 677 «Лада» стали наиболее комфортабельными из всех, построенных для советского и российского флота.

На корпусе субмарины устанавливается противогидроакустическое покрытие, слой которого достигает сорока миллиметров в толщину. Благодаря этому уменьшается собственная шумность, и поглощаются сигналы активных гидроакустических станций противника.

Силовая установка

Подводная лодка приводится в движение главным гребным электрическим двигателем СЭД-1. Мощность его составляет 4100 лошадиных сил. В качестве источника тока могут использоваться аккумуляторные батареи (в погруженном положении), или же генераторы 28ДГ, вырабатывающие постоянный ток совокупной мощностью в 2000 киловатт и подключенные к дизельным двигателям Д-49 (V-образные моторы с восемью цилиндрами).

Внешний вид дизельного двигателя Д-49

Кроме того, на борту имеются два вспомогательных электродвигателя ПГ-102М. Каждый из них развивает по 140 лошадиных сил. Предназначены эти моторы для винтовых выносных колонок, при помощи которых осуществляется подруливание.

К сожалению, воздухонезависимая энергетическая установка на подводных лодках проекта  677 в настоящее время не применяется. Параметры её неизвестны, хотя ранее представители КБ «Рубин» утверждали, что созданный ими анаэробный двигатель позволит субмарине, находящейся в погруженном состоянии, двигаться со скоростью до 10 узлов.

Целевое оборудование

Главным инструментом для поиска целей на подводных лодках проекта 677 является гидроакустический комплекс «Лира». В его состав входят следующие элементы:

  1. Шумопеленгаторные антенны. Главная из них, Л-01, размещена на носу субмарины. Две других находятся также в передней части лодки, но по бортам;
  2. Гидроакустическая станция с буксируемой антенной;
  3. Активная ГАС для осуществления связи под водой, измерения дистанции и поиска мин.

Обработка данных осуществляется боевой информационно-управляющей системой «Литий». В надводном положении может использоваться радиолокационная система КРМ-66.

Вооружение подлодок проекта 677

В носовом отсеке ДЭПЛ «Лада» находятся шесть торпедных аппаратов калибра 533. С их помощью осуществляется применение следующих средств поражения:

  1. Торпеды УСЭТ-80К. Дальность – до 18 км, скорость движения – 45 узлов;
  2. Торпеды (подводные ракеты) «Шквал». Дальность – до 13 км, скорость – 300 км/ч;
  3. Крылатые ракеты П-800 «Оникс». Предназначены для уничтожения надводных кораблей всех классов. Дальность запуска – до 600 км, скорость – 2М при полете над морем;
  4. Крылатые ракеты «Калибр».
Макет торпеды ТЭ-2

Первоначально предполагалось вооружить подлодку торпедами ТЭ-2, однако они оказались не готовыми к эксплуатации на момент спуска на воду головного «Санкт Петербурга». Если верить последним сообщениям, возможно использование как противокорабельных «Калибров», так и другого варианта этой ракеты, предназначенного для уничтожения наземных целей на дистанции в полторы тысячи километров и более.

В боекомплект подводной лодки входит до 18 торпед или ракет. Вместо них можно загрузить также 44 морские мины для выполнения скрытных постановок.

В некоторых публикациях утверждалось, что субмарины «Лада» оборудованы специальными вертикальными шахтами для залпового пуска ракет. Такой проект действительно существует. Он был разработан в качестве особой, экспортной, модификации и получил особое название «Амур-950». Одной из его особенностей, наряду с ракетными шахтами, стало сокращение количества торпедных аппаратов до четырёх.

Дальше проекта дело пока не пошло, поскольку зарубежные заказчики не проявили к «Амуру-950» практически никакого интереса. Связано это, скорее всего, всё с тем же, что и у «Лад», отсутствием воздухонезависимой силовой установки, без которой субмарина неконкурентоспособна.

Кроме того, несколько раз сообщалось о том, что подводные лодки проекта 677 предполагается  оснастить гиперзвуковыми противокорабельными ракетами «Циркон», однако, по наиболее свежей информации, это перспективное оружие на «Ладе» устанавливаться всё же не будет.

Проект подводной лодки «Амур-950» на базе «Лады». Хорошо видны вертикальные шахты для залпового запуска ракет

Технические характеристики

Водоизмещение 1765 тонн надводное, 2650 тонн подводное
Длина подводной лодки 66,8 м
Ширина 7,1 м
Осадка 6,7 м
Скорость надводная 10 узлов
Скорость подводная До 21 узла
Запас хода в надводном положении экономическим ходом До 16 000 миль
Запас хода при движении со шноркелем (РДП) До 6500 миль
Запас хода в подводном положении 650 миль
Рабочая глубина 240-260 м
Предельная глубина 300 м
Автономность 45 суток
Численность экипажа 35 человек

Воздухонезависимые двигатели, если они всё же появятся на «Ладах», в значительной степени улучшат характеристики этих подводных лодок.

Боевое и учебное применение

До сих пор в составе флота находилась лишь одна субмарина проекта 677 – «Санкт-Петербург». Использование её было исключительно опытным – проводилась отработка различных бортовых систем и оборудования. При этом было обнаружено огромное количество самых разных недоработок. Достаточно сказать, что после передачи подводной лодки заказчику выяснилось, что на борту полностью отсутствует гидроакустический комплекс – установлены только внешние антенны.

Мореходность корабля из-за плохо работающей силовой установки не позволяла осуществлять выходы из порта в условиях шторма и значительного волнения. Нарекания вызывали и многие другие узлы и агрегаты. В течение последующих лет большинство из обнаруженных дефектов были устранены, но и сегодня репутация у «Санкт-Петербурга» не блестящая.

В апреле эта субмарина выполнила испытательный запуск крылатой ракеты – почему-то непосредственно из базы.

Несмотря на успешное поражение цели, состояние подводной лодки и степень её боеготовности по-прежнему под вопросом.

Подводная лодка «Кронштадт» перед участием в военно-морском параде в Петербурге

Следующий корабль в этой серии, «Кронштадт», спущен на воду и проходит цикл испытаний. В июле 2020 года эта подводная лодка принимала участие в военно-морском параде в Петербурге.

К сожалению, субмарины проекта 677 пока что трудно признать удачными. Несмотря на то, что в публикациях их называют подводными лодками четвертого поколения, фактически они относятся к третьему. Их наиболее значительными плюсами считаются:

  1. Акустическая малозаметность. Как утверждают конструкторы, им удалось добиться снижения уровня шумности на 50% по сравнению с «Варшавянками»;
  2. Улучшенные характеристики гидроакустического комплекса. Точные значения тут не называются;
  3. Способность к применению наиболее передовых систем вооружения;
  4. Отличные условия пребывания на борту для экипажа.

Главный недостаток лодки очевиден – она не получила запланированной в соответствии с проектом силовой установки. В силу этого субмарины проекта 677 – такие же «ныряющие», как и их предшественницы, никакого развития в этом направлении не произошло. Кроме того, до сих пор нет детальной информации о том, удалось ли добиться полноценной работы гидроакустического комплекса.

Заявленная изготовителем способность залпового запуска пока никак не оценивалась. Скорее всего, этой характеристикой должны были обладать подводные лодки «Амур-950», но они всё ещё не построены.

Строительство подводной лодки проекта 677 «Великие Луки»

В целом же можно предположить, что субмарины проекта 677 не вытеснят, а скорее дополнят дизельные подлодки «Палтус» и «Варшавянка», уже имеющиеся в составе ВМФ России. Уменьшенное водоизмещение позволит применять новые лодки в первую очередь близ морского побережья.

Подводные лодки проекта 677 Лада

 Подводные лодки проекта 677 (шифр «Лада») — серия российских дизель-электрических подводных лодок, разработанных в конце XX века в ЦКБ «Рубин». Предназначаются для выполнения разведывательных и диверсионных мероприятий против надводных кораблей и подлодок противника, защиты прибрежных районов от вражеских десантов, а также для постановки минных заграждений и прочих подобных задач.

 Подводные лодки проекта 677 «Лада» — видео

Таким образом, подводная лодка «Лада», является оптимально подходящей именно для задач современной войны, которая требует максимальной мобильности и незаметности. Особенностью подлодок этой серии является схема их постройки, называемая «полуторной». Дело в том, что корпус (изготовленный из стали АБ-2) имеет одинаковый диаметр по всей длине. В отличие от больших атомных лодок, нос и корма имеют хорошо выраженную сферическую форму. Благодаря переборкам корпус делится на пять независимых отсеков. Палуб на корабле три.

Впечатляющие гидродинамические характеристики обеспечиваются благодаря корпусу специально разработанной, особенно хорошо обтекаемой формы. Выдвижные устройства имеют точно такое же заграждение, которым характеризуются корабли проекта 877, но кормовое оперение сделано крестообразным, а передние рули смонтированы на ограждении. Сделано это для того, дабы они создавали как можно меньше помех при работе гидролокационного оборудования, которым оснащена подводная лодка. Проект «Лада» в этом смысле является настоящим эталоном: она чрезвычайно тихая, ее крайне сложно обнаружить средствами гидролокации и гидроакустики.

Вооружение подлодки проекта 677 «Лада»


Главным средством защиты и нападения являются шесть аппаратов для запуска торпед калибра 533 мм, причем две шахты на верхней палубе предназначены для стрельбы управляемыми боеприпасами. В стандартный боезапас входит 18 торпед. Чаще всего подводная лодка «Лада 677» использует боеприпасы универсального типа (САЭТ-60М, УГСТ), специальные торпеды для уничтожения вражеских подлодок. На борту могут находиться крылатые ракеты, а также 22 мины модели ДМ-1.

Имеется возможность боевого использования противолодочных ракет типа «Шквал». Система ведения огня допускает как одиночные выстрелы, так и залповые стрельбы из шести шахт одновременно. За перезарядку торпедных аппаратов отвечает комплекс «Мурена», который позволяет провести всю операцию в полностью автоматическом режиме. Весь процесс полностью контролируется из командного командирского пункта, которым оборудована подводная лодка. Проект «Лада» был первой в Советском Союзе разработкой неатомного подводного корабля, в котором бы использовалось такое количество сложной и высокоэффективной автоматики.

Чтобы обеспечить защиту лодки от боевой авиации противника, экипаж может воспользоваться шестью ПЗРК модели «Игла-1М». Координация работы всех боевых систем обеспечивается посредством использования системы «Литий». Таким образом, подводная лодка «Лада», вооружение которой мы расписали, при своих небольших габаритах способа доставить большие проблемы любому противнику.

Гидролокационный комплекс

За гидролокационную разведку отвечает комплекс «Лира», в состав которого входят мощные чувствительные антенны. В состав установки входит сразу три антенны, одна из которых расположена на носу подводной лодки, а две – смонтированы по ее бокам. Инженеры максимально увеличили их диаметр ради точности измерения подводных шумов. Так, передняя антенна занимает едва ли не все пространство на носу подлодки. На случай повреждения бортового оборудования имеется выпускаемая гидролокационная аппаратура, которую подводная лодка «Лада» (проект 677) может буксировать за собой на марше.

 

Система навигации

Навигационная система – инерциального типа. Отвечает за предоставление данных о точном месторасположении корабля, а также за определение той оптимальной скорости, при которой имеющееся на борту вооружение может быть использовано с максимальной эффективностью.

В составе системы имеется перископное оборудование типа УПК «Парус-98», в состав которого входят следующие элементы:

  •  Непроникающий перископ командирский, «Парус-98КП». Имеет дневной и низкоуровневый каналы (оптический и ТВ). Степень увеличения варьируется от 1,5 до 12Х, есть возможность видеозаписи наблюдаемых данных.
  •  Мачта оптронная, непроникающего типа «Парус-98УП». Фактически является многофункциональным универсальным перископом. В составе конструкции – два канала (дневной и низкоуровневый), степень увеличения – как у командирского телескопа, имеется высокоэффективный лазерный дальномер.

Таким образом, подводная лодка «Лада», ТТХ которой мы вкратце расписали, может с равным успехом использоваться в дневных и ночных условиях. Она всегда оставаясь незаметной для противника.

Прочие элементы навигационной системы

Важнейшим элементом является радиолокационная система модели РЛС КРМ-66 «Кодак». Включает в свой состав активный и пассивный радиоканалы, может работать в совмещенном режиме. При активном использовании может быть активирован особо защищенный, скрытый канал связи. Он дает полную картину окружающей подлодку обстановки (в том числе и надводной), но при этом никак не демаскирует корабль. В этом смысле подводная лодка «Лада» (проект 677) является во многом уникальным объектом, аналогов которого в мире действительно нет, как бы избито не звучало данное выражение.

Цифровая система связи модели «Дистанция». Позволяет обмениваться информацией по двунаправленному защищенному каналу передачи информации с береговыми командными пунктами, кораблями и самолетами (при условии нахождения на перископной глубине). Если возникает необходимость отправить экстренно важное сообщение с большой глубины, используется выпускная буксируемая антенна. Это оборудование находится в особо прочном корпусе, способном защитить его даже в случае боевых действий. Проще говоря, «Лада» — лодка весьма живучая.

Наконец, комплекс навигационного оборудования «Аппассионата». Содержит систему навигации инерциального типа, а также модуль спутниковой навигации GPS/ГЛОНАСС. Точность определения местонахождения при его использовании чрезвычайно велика, но зависит от близости расположения базовой станции корректировки для того или иного «провайдера».

Силовая установка

«Сердцем» подлодки является дизель-электрическая силовая установка, выполненная по схеме, которая предусматривает движение исключительно на электрическом ходу. Этим и отличается от зарубежных аналогов подводная лодка «Лада». ТТС (транспортно-технические системы) зарубежных кораблей этого класса могут обеспечивать движение только на дизельном двигателе.

Дизельный двигатель располагается в четвертом отсеке. Для выработки электричества служат два генератора марки 28ДГ, сопряженные с выпрямителями мощностью по 1000 кВт каждый. Энергия запасается в двух группах аккумуляторных батарей. В каждой из них находится 126 элементов (они находятся в первом и третьем отсеках). Общая совокупная мощность всей установки в пиковом состоянии — 10580 кВт/ч. Рабочий двигатель – электрический, возбуждается постоянными магнитами. Марка СЭД-1, удельная мощность равна 4100 кВт.

Выбранная мощность двигателя и емкость аккумуляторных батарей не случайны. Дело в том, что именно при таком соотношении становится возможной ускоренная загрузка батарей, которая практически в два раза сокращает нахождение подлодки на перископной глубине. Так как в составе генератора нет щеточного токосъемного устройства, обслуживание и эксплуатация всей установки резко упрощается и становится намного безопаснее. В этом отношении «Лада» — лодка, во многом опередившая свое время.

Основная схема работы двигателей

Всережимная электрическая силовая установка исполняет роль главного движителя во всех походных состояниях корабля. В принципе, мы уже говорили о том, что движения на одном только дизельном ходе не предусмотрено в принципе. Гребной винт имеет семь лопастей, выполнен по особой, малошумной технологии. Такое положение вещей во многом было достигнуто благодаря саблевидной форме лопастей, которая выдает минимальный уровень шума при движении. Кроме того, подлодка имеет две выносных рулевых колонки марки РДК-35.

Максимально достижимая скорость в надводном положении достигает 21 узла. В подводном положении подлодка не разгоняется свыше 10 узлов. Дальность плавания составляет порядка 6000 миль, но при движении экономичным ходом можно увеличить ресурс приблизительно еще на 650 миль.

Об условиях жизни и работы экипажа судна

В состав экипажа входит 35 человек. Для спасения людей в случае ЧП предусмотрена спасательная система КСУ-600. Она предполагает дистанционный автоматический выпуск спасательных плотов модели ПСНЛ-20. Всего их две штуки, они расположены в надстройке для выдвижных устройств. Жилая зона на подлодке располагается в третьем отсеке. В отличие от надводных кораблей СССР и РФ, для экипажа созданы весьма неплохие условия проживания. Для личного состава предназначены двухместные каюты. Каждому офицеру положено отдельное помещение.

Прием пищи происходит в кают-компании, совмещенной с буфетной комнатой. Запасы пищи, в зависимости от их характеристик и требований к хранению, располагаются в охлаждаемых и неохлаждаемых кладовых. В последние годы на подлодки этой серии стали устанавливать камбузное оборудование нового образца: при весьма компактных размерах оно обеспечивает приготовление полноценного и разнообразного пищевого довольствия экипажа.

Запасы пресной воды хранятся в цистернах из пищевой нержавеющей стали. Пополнить запас пищевой пресной воды можно прямо в походных условиях. Для этой цели предусмотрены опреснительные установки, которые для работы используют тепло от работающих дизельных двигателей. В общем и целом, при штатном протекании похода запасов воды вполне достаточно для обеспечения не только бытовых, но и технических нужд. Полностью загруженная всем необходимым подлодка остается автономной на протяжении 45 суток.

Что нового?

Нововведений в конструкцию хорошо себя зарекомендовавшего корабля будет внесено немало. Разработчиком выступает знаменитое предприятие ЦКБ МТ «Рубин». В середине 2013 года было окончательно решено, что подводная лодка «Лада» продолжит стоять на вооружении ВМФ РФ. В модернизированном, конечно же, варианте. Большое внимание отечественные специалисты уделили модернизации бортовых электронных систем. Была полностью переосмыслена автоматика торпедной установки, практически полностью переделана (с учетом использования современных технологий) механика электрической силовой установки. Не осталась «обойденной» и навигация: учитывая, сколько новых решений было в нее заложено, можно смело говорить о том, что эта система заново создана. Неудивительно, что такая подводная лодка «Лада» неминуемо привлекает внимание иностранных заказчиков.

На сегодняшний день субмарины проекта 677 «Лада» стали одними из наиболее совершенных неатомных подводных лодок во всем мире. Можно с уверенностью говорить о том, что при условии сохранения темпов работ их с удовольствием будет приобретать не только отечественный ВМФ, но и многие иностранные заказчики, поддерживая бюджет страны.

Модификации

«Амур-950» — экспортная модификация проекта 677 «Лада» оснащена четырьмя торпедными аппаратами и УВП на десять ракет, способна произвести залп из десяти ракет за две минуты. Экипаж — 18 (по другим данным 21) человек. Автономность — 30 суток. Глубина погружения — 250 метров.

«Амур-1650» — ещё одна экспортная модификация. Имеет шумопеленгаторную антенну, способную обнаруживать особо малошумные цели, может дать залп из шести ракет.

 

Представители

Б-585 «Санкт-Петербург» — находится в опытной эксплуатации до 2016 года

Б-586 «Кронштадт» — до середины 2012 года строительство было заморожено и возобновлено только 09.07.2013

Б-587 «Великие Луки» — лодка была перезаложена 19 марта 2015 года

Тактико-технические характеристики подводных лодок 677 «Лада»

Тип корабля……………..многоцелевая ДЭПЛ
Скорость (надводная)……………..10 узлов
Скорость (подводная)……………..21 узел
Рабочая глубина погружения……………..250 м
Предельная глубина погружения……………..00 м
Автономность плавания……………..45 (30 для «Амур-950») суток
Экипаж……………..35 (21 для «Амур-950») человек
Водоизмещение надводное……………..1 765 (1 150) т
Водоизмещение подводное……………..н/д
Длина наибольшая (по КВЛ)……………..66,8 (58,8) м
Ширина корпуса наиб………………7,1 (5,65) м
Силовая установка ГЭУ с полным электродвижением. ……ДГ с двигателями Д49; ВНЭУ на ТЭ (в перспективе)
Торпедно-минное вооружение…….6 ТА калибра 533 мм, 18 (16) торпед УСЭТ-80К, до 44 мин
Ракетное вооружение……УВП на 10 ракет РК П-800 «Оникс» и/или «Калибр»
ПВО……………..ПУ ПЗРК «Игла-1М», 6 ЗУР в ТПК

 

Подводная лодка проекта 677 «Лада» — фото с парада в Санкт-Петербурге


Подводные лодки проекта 677 «Лада»

Толкование

Подводные лодки проекта 677 «Лада»

Подводная лодка
Название = ДПЛ проекта 677 «Лада»
Оригинал названия =
Иллюстрация:



Подпись = Модели подводных лодок проекта 667Э «Амур-1650» (сверху) и «Амур-950»
Флаг =
Порт =
Спущен = 2004 (Б-585 «Санкт-Петербург»)
Выведен =
Статус = 1 проходит испытания,
2 достраиваются
Тип = Многоцелевая ДПЛ
Проект = 677 «Лада»
КБ =
Главный конструктор =
NATO = «Lada»
Силовая установка = Дизель-электрическая, с полным электродвижением и воздухонезависимыми генераторами
Скорость надводная = 10 узлов
Скорость подводная = 21 (20) узел
Рабочая глубина = 250 м
Предельная глубина = 300 м
Экипаж = 35 (21характеристики в скобках даны для «Амур-950»] ) человек
Автономность = 45 (30) суток
Водоизмещение = 1765 (1150) т [ [http://www. ckb-rubin.ru/rus/project/submarine/noatompl/ Неатомные подводные лодки] ]
Водоизмещение полное =
Длина = 66,8 (58,8) м
Ширина = 7,1 (5,65) м
Высота =
Осадка =
Артиллерия =
Торпеды = 6 ТА калибра 533 мм, 18 (16) торпед УСЭТ-80К, до 44 мин
Ракеты = ракето-торпеды вместо части торпед (10 вертикальных пусковых установки)
ПВО = ПУ ПЗРК «Игла-1М», 6 ракет
Авиация =
Стоимость =
commons =
Стоимость =
commons = Category:Lada class submarine

Подводные лодки проекта 677 «Лада» — серия российских дизель-электрических подводных лодок, разработанных в конце XX века. Генеральный конструктор проекта Юрий Кормилицин. Основной особенностью серии является сочетание небольших размеров и низкого уровня шумности с мощным торпедным и торпедо-ракетным вооружением.

Лодки предназначаются для уничтожения субмарин, надводных кораблей и судов противника, защиты военно-морских баз, морского побережья и морских коммуникаций, ведения разведки. Серия является развитием проекта 877 «Палтус».

Амур-950

Лодки серии «Амур-950» — это экспортный вариант лодок проекта 677 «Лада», который является логическим продолжением лодок проектов 877 «Палтус»/636 «Варшавянка».

Подводная лодка «Амур-950» оснащена четырьмя торпедными аппаратами и десятью вертикальными пусковыми установками для противокорабельных ракет.Экипаж — 18 (по другим данным 21) человек. Автономность — 30 суток. Глубина погружения — 250 м.

Конструкция

Впервые с 1940-х годов использована однокорпусная схема [http://nvo.ng.ru/armament/2004-11-12/6_peterburg.html «Подводный охотник» вышел в плавание, nvo.ng.ru, 2004-11-12] ] .

По сравнению с двухкорпусной «Варшавянкой» надводное водоизмещение снижено почти в 1,3 раза — с 2300 до 1765 тонн. Скорость полного подводного хода увеличена с 19 до 21 узла. Состав экипажа уменьшен с 52 до 34 подводников, автономность увеличена до 45 суток. Лодки типа «Лада» отличаются очень низким уровнем шумности, высоким уровнем автоматизации и относительно небольшой ценой по сравнению с зарубежными проектами: немецким типом 212, и франко-испанским проектом «Scorpene», обладая при этом более мощным вооружением.

Подлодка оснащена автоматизированной системой боевого управления «Литий».

Представители

Для ВМФ России планируется постройка 50 единиц. [ [http://www.rian.ru/spravka/20080319/101719454.html Виды подводных лодок на вооружении РФ. Справка, rian.ru, 19/ 03/ 2008] ]

Строятся на «Адмиралтейских верфях» в Санкт-Петербурге.
* Б-585 «Санкт-Петербург» — заложена в 1997 году, спущена со стапелей 28 октября 2004 года, в 2005 году готовилась к испытаниям, принятие на вооружение планировалось в 2006 году, но позднее было перенесено на декабрь 2007 года.
* Б-586 «Кронштадт» — заложена 28 июля 2005 года.
* Б-587 «Севастополь» — заложена 10 ноября 2006 года.

Принятие на вооружение

Согласно планам модернизации Российского подводного флота ДЭПЛ проекта 677 «Лада» станут одним из четырёх типов подводных лодок, принятых на вооружение. [http://student.km.ru/view.asp?id=ABEF618D923842F49AF4A8A92798B31D&fp=1&fl=20&sort=1 Российский военный флот меняет облик, 8 апреля 2008] ] Одной из особенностей советского и российского подводного флота являлось использование десятков различных типов и модификаций субмарин, что значительно затрудняло их эксплуатацию и судоремонт.

См. также

* Подводные лодки проекта 212

Ссылки

* [http://www.vpk-news.ru/article.asp?pr_sign=archive.2004.60.articles.weapon_01 Наконец-то, дождались…, Александр Карпенко, ВПК № 43 (60), 10 — 16 ноября 2004 года]
* [http://www.navy.ru/news/vpk/?ELEMENT_ID=1886 Дизель-электрическая подводная лодка 4-го поколения «Санкт-Петербург» будет сдана флоту в опытную эксплуатацию в конце года] 03.07.2007
* [http://www.ckb-rubin.ru/rus/project/submarine/noatompl/ Неатомные подводные лодки, ckb-rubin.ru]
* [http://www.deepstorm.ru/DeepStorm.files/on_1992/677/list.htm deepstorm.ru // Проекты 677 «Лада» и 677Э «Амур-1605»]
* [http://lenta.ru/articles/2007/10/10/sub/ Das Boot, Илья Крамник, lenta.ru, 10.10.2007]

Примечания

Wikimedia Foundation. 2010.

Поможем написать реферат

  • В глубине (фильм)
  • Фридрих, Арне

Полезное


В ОСК рассказали про проблемы со строительством новейших подлодок «Лада» — 4 сентября 2020

Общество

4 сентября 2020, 07:53

7 комментариев

Серийное строительство двух дизель-электрических подводных лодок четвертого поколения проекта 677 «Лада» идет с отставанием из-за проблем с одним из поставщиков оборудования, сообщил РИА Новости 4 сентября глава Объединенной судостроительной корпорации (ОСК) Алексей Рахманов.

К настоящему времени построена головная лодка проекта 677 «Лада» под названием «Санкт-Петербург», которая находится в опытной эксплуатации в составе ВМФ. Две другие лодки этого проекта «Кронштадт» и «Великие Луки» строятся уже более 15 лет.

«Нам очень хочется разобраться с фундаментальными проблемами, которые мы имеем по этим лодкам, потому что технически один из наших поставщиков не справился с работоспособностью оборудования. Из-за этого завершение строительства первых двух серийных кораблей идет с отставанием. Уперлись в невозможность передачи лодок в том виде, в котором они сейчас есть. Как только эта проблема будет решена, то будем готовиться к завершению строительства», — сказал Рахманов.

Подводные лодки проекта 677 «Лада» относятся к четвертому поколению неатомных подводных лодок и на сегодняшний день признаны самыми современными и перспективными отечественными неатомными подводными кораблями как с точки зрения боевой эффективности, так и по другим тактико-техническим характеристикам.

По теме

  • Построенная в Петербурге подлодка исчезла с радаров в Средиземном море. Ее ищут силами НАТО

    18 марта 2021, 17:42

УДИВЛЕНИЕ0

ПЕЧАЛЬ0

Комментарии 7

читать все комментариидобавить комментарий
ПРИСОЕДИНИТЬСЯ

Самые яркие фото и видео дня — в наших группах в социальных сетях

  • ВКонтакте
  • Телеграм
  • Яндекс.Дзен

Увидели опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl+Enter

Новости СМИ2

сообщить новость

Отправьте свою новость в редакцию, расскажите о проблеме или подкиньте тему для публикации. Сюда же загружайте ваше видео и фото.

  • Группа вконтакте

Новости компаний

Комментарии

7

Новости компаний

Портфель карт «Мир», эмитированных Банком «Санкт-Петербург», за год вырос на 21%

В сентябре 2022 года будет 6 лет, как Банк «Санкт-Петербург» начал эмиссию карт национальной платёжной системы «Мир». Сегодня карты ПС «Мир» выбирают все больше клиентов БСПБ. Портфель карт «Мир» Банка «Санкт-Петербург» за год (с 1.09.2021г. по 01.09.2022г.) вырос на 21%. Банк «Санкт-Петербург» приступил к эмиссии карт ПС «Мир» в сентябре 2016 года. Первыми картами, которые были «переведены» на «Мир» стали «Пенсионные» карты Банка. Подробнее о «семействе» карт «Мир» в БСПБ можно узнать на сайте Банка —…

В Пушкинском районе Санкт-Петербурга готовятся к вводу в эксплуатацию ЖК «Образцовые кварталы 9 и 10»

Объекты построены в рамках комплексного освоения территории на подъезде к Пушкину. Девелопер и основной застройщик проекта — строительная компания «Терминал-Ресурс» Проект занимает площадь 316 га, его реализация рассчитана на 15–20 лет. Сейчас построены и заселены восемь «Образцовых кварталов». Проходит инженерная проверка ЖК «Образцовые кварталы 9 и 10». Продолжается строительство и проектирование следующих новостроек. Ранее застройщик сдал в эксплуатацию детский сад, бизнес-центр «Перспектива», паркинг «Гараж». Ведётся развитие…

Банк «Санкт-Петербург» поздравляет с Днем финансиста и подводит итоги программы «Будущий банкир»

Банк «Санкт-Петербург» поздравляет всех профессионалов финансовой отрасли с Днем финансиста, который в России отмечается 8 сентября, и подводит итоги стажерской программы для студентов и выпускников вузов «Будущий банкир». Программа стажировки «Будущий банкир» в этом году отмечает 10-летний юбилей. С 2012 года БСПБ готовит из студентов старших курсов и выпускников российских вузов профессионалов — универсальных банковских экспертов. Зачисление на стажерскую программу «Будущий банкир» происходит полностью онлайн, такой формат особенно удобен…

ТОП 5

1

На камеры попало, как пенсионер несет в квартиру в Петербурге желанную установку. Он еще не знает, что она обойдется ему в 1,5 млн

105 748

232

«Это катастрофа». Почему этой осенью в лесах Ленобласти нет грибов

99 194

343

Песков ответил на вопрос о мобилизации в России

78 086

1214

«Окна задрожали». Ростовчане рассказывают о «громком взрыве»

75 167

585

Сенатор Климов ответил, нужна ли России мобилизация

70 286

68

Новости компаний

ВЗГЛЯД / Стало известно о скорой передаче ВМФ двух ДЭПЛ проекта 677 «Лада» :: Новости дня

15 сентября, четверг  |  Последнее обновление — 05:25  |  vz.ru

Разделы

XinHua/Global Look Press

Китайский самолет C919 впервые будет передан авиакомпании в коммерческую эксплуатацию на два года раньше российского конкурента – лайнера МС-21. Оба проекта развивались параллельно и совершили свои первые полеты даже в один месяц и год. Однако первым в жизнь выпускается китаец. Впрочем, на этом преимущества китайского лайнера заканчиваются. Чем МС-21 превосходит своего соперника? Подробности…

  • Финляндия конфисковала связанные с Россией активы почти на 190 млн евро
  • Появились сообщения о намерении Samsung вернуться в Россию
  • Посол указал на превращение Украины в полигон НАТО

Перейти в раздел…

РИА Новости

ВС Украины продолжают концентрировать войска у линии фронта в Запорожской области. По данным местных властей, объем техники и живой силы, сосредоточенной противником, беспрецедентны для этого региона. На каких направлениях стоит ожидать ударов ВСУ, как их можно предотвратить и за счет чего российская армия могла бы развить свой успех на этом направлении? Подробности…

  • Сенаторы США предложили законопроект об объявлении России «спонсором терроризма»
  • Россия собралась выкинуть на свалку истории «порядок, основанный на правилах»
  • Большинство жителей Словакии пожелали победы России над Украиной

Перейти в раздел…

State Security Service of Ukraine/REUTERS

На Москву вновь посыпались обвинения со стороны Киева, который утверждает, что российские военные якобы устраивали пытки и массовые убийства населения в Харьковской области. Все указывает на то, что Украина в находившихся под контролем России населенных пунктах области готовит повторение провокации по образцу Бучи – с предъявлением трупов «жертв оккупации». На роль жертв неонацисты определили сторонников России.  Подробности…

  • Военкор предложил использовать СВО для обучения «крепких командиров»
  • Россиянам посоветовали не посещать граничащие с Азербайджаном районы Армении
  • Ресторан Моргенштерна закрыли в Москве на три месяца

Перейти в раздел…

Global Look Press via ZUMA Press

Анкара потребовала от киевских властей отчета – на каком основании началась травля ведущих турецких бизнесменов. В Киеве поступили привычно – имена предпринимателей, обвиненных в сотрудничестве с Россией, отправили в черный список на сайт, который курирует МИД Украины. Введет ли Киев санкции против работающих с Россией представителей турецкого бизнеса и чем это для него чревато? Подробности…

  • Европу предупредили о невозможности для США увеличить поставки газа и нефти
  • В Грузии назвали идею референдума о «втором фронте» против России сарказмом
  • Азербайджан не понял, кого Индия считает агрессором

Перейти в раздел…

кадр из видео

Установлена исполнительница теракта, в котором была убита журналист Дарья Дугина. По данным ФСБ, преступление совершила гражданка Украины Наталья Вовк. Эксперты полагают, что у террористки могли быть сообщники, а в подготовке преступления задействованы страны ЕС. Удастся ли Москве добиться выдачи Вовк из Европы, куда та смогла скрыться после убийства Дугиной? Подробности…

  • Романа Полански обвинили в домогательствах к 16-летней актрисе
  • При падении неизвестного летательного аппарата на Ставрополье пострадал пожарный
  • Депутата заподозрили в крупном мошенничестве с землей в Новосибирске

Перейти в раздел…

Начинается саммит Мирового большинства
Тимофей Бордачёв, Программный директор клуба «Валдай»

Саммит Шанхайской организации сотрудничества станет важным событием в жизни Мирового большинства. Многие страны уже сейчас готовы не только пассивно саботировать усилия США по сохранению своей монополии, но и работать над альтернативными решениями. Подробности…

Умер «последний советский кинематографист»
Алексей Зензинов, сценарист, драматург

Чему нам стоит поучиться у великого француза? Любви к России и русскому советскому киноискусству. «Россия – это страна, куда я всегда хотел бы поехать, – говорил Жан-Люк Годар. И тут же добавлял. – Но не туристом и не на кинофестиваль». Подробности…

Швеция как недооцениваемая угроза для России
Вадим Трухачёв, политолог, кандидат исторических наук, доцент РГГУ

Если считать Германию и Францию «первой лигой» принятия решений в Европе, то Швеция стоит прямо под ними – и разделяет их не пропасть. А уж вместе с другими странами Северной Европы она тем более представляет собой определенную силу. Подробности…

Обсуждение: 6 комментариев

  • Украинцев возмутило новогоднее обращение Зеленского
  • По факту нападения на росгвардейцев на незаконной акции в Москве возбуждены новые дела
  • Глава ВЦИОМ назвал россиян «тоскующими индивидуалистами»

Перейти в раздел…

Сборная России по футболу возвращается в игру

Обсуждение: 8 комментариев

Таким образом, подводная лодка «Жигули», особенно оптимально подходит для решения задач современной войны, где требуется максимальная мобильность и скрытность. Особенностью подводных лодок этой серии является схема их постройки, получившая название «три четверти». Дело в том, что корпус (из стали АВ-2) имеет одинаковый диаметр по всей длине. В отличие от больших атомных подводных лодок нос и корма имеют четко выраженную сферическую форму. За счет переборок корпус разделен на пять отдельных секций. Три палубы на корабле.

Впечатляющие гидродинамические характеристики обеспечиваются специально разработанным корпусом, особенно хорошо обтекаемой формы. Выдвижное устройство имеют точно такое же ограждение, которое было характерно для кораблей проекта 877, но кормовое оперение выполнено крестообразным, а передние колеса установлены на ограждении. Это для того, чтобы они создавали как можно меньше помех в гидроакустической аппаратуре, которой оснащена подводная лодка. Проект «Гармония» в этом смысле — настоящий эталон: он очень тихий, его крайне сложно обнаружить с помощью сонара и подводной акустики.

Вооружение ПЛ проекта 677 «Лада»


Основными средствами обороны и нападения являются шесть аппаратов для пуска торпед калибра 533 мм, а две мины на верхней палубе предназначены для стрельбы управляемыми боеприпасами. Стандартный боекомплект части 18 торпед. Чаще всего ПЛ «Лада 677» использует боеприпасы родового типа (САЭТ-60М, УГСТ), специальные торпеды для поражения подводных лодок противника. На борту могут находиться крылатые ракеты и 22 мины модели ДМ-1.

Возможно боевое применение противолодочных ракет типа «Шквал». Система стрельбы позволяет вести как одиночные выстрелы, так и залповую стрельбу шестью минами одновременно. Во время перезарядки отвечает торпедный комплекс «Мурена», что позволяет проводить всю операцию в полностью автоматическом режиме. Весь процесс полностью контролируется из командования командира десанта, которым оснащена подводная лодка. «Лада» стала первой в Советском Союзе разработкой неатомного подводного корабля, в котором предполагалось использовать ряд сложных и высокоэффективных средств автоматизации.

Для защиты катера от боевых самолетов противника экипаж может воспользоваться шестью моделями ПЗРК «Игла-1М». Координация всех боевых систем обеспечивается за счет использования системы «Литий». Таким образом, подводная лодка «Лада», вооружение которой мы расписали, своими малыми габаритами способна доставить большую проблему любому противнику.

Гидроакустический комплекс

За гидролокационную разведку отвечает комплекс «Лира», состоящий из мощной чувствительной антенны. В состав блока входят сразу три антенны, одна из которых расположена в носовой части подлодки, а две — установлены по бортам. Максимальный диаметр инженеров для повышения точности измерения подводного шума. Так, передняя антенна занимает почти все пространство в носовой части подлодки. На случай повреждения бортового оборудования изготовили гидроакустическую аппаратуру, благодаря которой ПЛ «Лада» (проект 677) может буксироваться за походным.

Навигационная система

Навигационная система — инерциального типа. Он отвечает за предоставление информации о точном местоположении корабля, а также определение оптимальной скорости, при которой бортовое вооружение могло бы применяться с максимальной эффективностью.

В составе системы имеется перископическое оборудование типа УПК «Парус-98», в состав которого входят следующие элементы:

  • Проникающий перископ командирский «Парус-98КП». В нем есть дневные и низкоуровневые каналы (оптический и ТВ). Степень увеличения варьируется от 1,5 до 12 крат. Имеет возможность видеозаписи наблюдаемых данных.
  • Мачта оптронная, непробиваемая типа «Парус-98УП». Фактически это многофункциональный универсальный перископ. В составе конструкции — два канала (штатный и низкоуровневый), степень увеличения — как в командирском прицеле, имеется высокопроизводительный лазерный дальномер.

Таким образом, ПЛ «Лада», ТТХ мы кратко расписали, может с одинаковым успехом эксплуатироваться в дневных и ночных условиях. Он всегда остается невидимым для врага.

Прочие элементы навигационной системы

Важнейшим элементом радиолокационного комплекса является РЛС КРМ-66 «Кодак». Включает в свой состав активное и пассивное радио, может работать совместно. При активном использовании можно активировать особо защищенную, скрытую ссылку. Он дает полную картину обстановки вокруг подводной лодки (в том числе надводной), но не демаскирует корабль. В этом смысле подводная лодка «Лада» (проект 677) является во многом уникальным объектом, аналогов которому толком нет в мире, как бы не избито звучало это выражение.

Система цифровой связи «Дистанционная» модель. Обеспечивает обмен информацией по защищенному каналу двунаправленной передачи информации на береговые пункты управления, корабли и самолеты (обеспечивается на перископной глубине). Если вам нужно отправить срочно важное сообщение с большой глубины, используйте вытяжную буксируемую антенну. Эта техника очень прочная, ее можно защитить даже в случае военных действий. Проще говоря, «Жигули» — лодка очень живучая.

Наконец, комплекс навигационного оборудования «Аппассионата». Содержит систему навигации инерциального типа, а также модуль спутниковой навигации GPS/ГЛОНАСС. Точность определения местоположения при его использовании чрезвычайно высока, но зависит от местоположения базовой станции с поправками на близость «провайдера».

Силовая установка

«Сердцем» подводной лодки является дизель-электрическая энергетическая установка, выполненная по схеме, обеспечивающей движение только на электрическом ходу. Этим отличается от зарубежных аналогов подводная лодка «Лада». ТСТ (транспортно-технические системы) иностранных судов этого класса могут обеспечить движение только на дизеле.

Дизельный двигатель расположен в четвертом отсеке. для выработки электроэнергии используются два генератора марки 28ДГ, связанные с выпрямителями мощностью по 1000 кВт каждый. Энергия хранится в двух группах батарей. В каждом из них по 126 элементов (они в первом и третьем отсеках). Суммарная суммарная мощность всей установки в пиковом режиме – 10580 кВт/ч. Рабочий двигатель — электрический, возбуждается постоянными магнитами. Марка района 1, удельная мощность равна 4100 кВт.

Выбранная мощность двигателя и емкость аккумуляторов не случайны. Все дело в том, что именно при таком соотношении становится возможным выразить загрузку батареи, что почти в два раза снижает нахождение подводной лодки на перископной глубине. Так как часть генератора не является проскальзывающим щеточным устройством, обслуживание и эксплуатация всей установки значительно упрощается и становится намного безопаснее. В этом отношении «Жигули» — лодка, во многом опередившая свое время.

Принципиальная схема работы двигателей

Электрическая двигательная установка с регулируемой скоростью играет главную роль во всех походных состояниях корабля. В принципе, мы уже говорили о том, что движение на дизеле самостоятельным курсом предусмотрено в принципе. Винт имеет семь лопастей, изготовленных по специальной малошумной технологии. Такое положение дел во многом было достигнуто благодаря форме саблевидных лопастей, дающей минимальный шум при движении. Кроме того, подлодка имеет две выносные рулевые колонки марки РДК-35.

Максимально достижимая скорость в надводном положении достигает 21 узла. В подводном положении подводная лодка не разгоняется свыше положения 10 узлов. дальность плавания составляет около 6000 миль, но при езде экономический прогресс может увеличить срок службы примерно еще на 650 миль.

Об условиях проживания и работы экипажа

В состав экипажа входило 35 человек. Для спасения людей в случае возникновения аварийной ситуации предусмотрена система спасения КСУ-600. В нем задействованы автоматические спасательные плоты с дистанционным сбросом модели ПСНЛ-20. Всего две штуки, они расположены в надстройке за выдвижными устройствами. На подводной лодке кв.м находится в третьем отсеке. В отличие от надводных кораблей СССР и РФ, для экипажа созданы очень хорошие бытовые условия. двухместные каюты предназначены для личного состава. Каждому офицеру отведена отдельная комната.

Прием пищи происходит в кают-компании, совмещенной с кладовой. продукты питания, в зависимости от их характеристик и требований к хранению, размещаемые в охлаждаемых и неохлаждаемых кладовых. В последние годы на подводные лодки этой серии стали устанавливать камбузное оборудование нового образца: при очень компактных размерах оно позволяет готовить полный и разнообразный пищевой рацион экипажа.

Пресная вода хранится в резервуарах из нержавеющей стали. Доливать пищевую пресную воду можно прямо в полевых условиях. Для этого предусмотрены опреснительные установки, для работы которых используется тепло от дизельных двигателей. В целом при нормальных подъемах стока воды достаточно для обеспечения не только бытовых, но и технических нужд. Полностью загруженная всем необходимым подлодка автономна 45 суток.

Что нового?

Нововведений в конструкцию проверенного корабля будет внесено немало. Застройщиком выступает известная компания ЦКБ МЭ «Рубин». В середине 2013 года было окончательно принято решение, что подводная лодка «Гармония» продолжит нести службу в ВМФ России. В модернизированном, разумеется, варианте. Большое внимание отечественные специалисты уделили модернизации бортовых электронных систем. Была полностью переработана торпедная автоматическая установка, почти полностью переделана (с учетом применения современных технологий) механическая электрическая силовая установка. Не остается «обойденной» и навигация: учитывая, сколько новых решений в нее заложено, можно смело сказать, что система переналажена. Неудивительно, что такая подводная лодка «Лада» неизбежно привлекает внимание зарубежных заказчиков.

На сегодняшний день подводная лодка проекта 677 «Лада» стала одной из самых совершенных неатомных подводных лодок в мире. Можно с уверенностью сказать, что при сохранении темпов работ они были бы рады приобрести не только ВМФ России, но и многих зарубежных заказчиков, поддерживающих бюджет страны.

модификации

«Амур-950» — экспортный вариант проекта 677 «Жигули» оснащен четырьмя торпедными аппаратами УВП и десятью ракетами, способными произвести залп десятью ракетами за две минуты. экипаж — 18 (по другим данным 21) человек. автономность — 30 дней. Глубина погружения — 250 м.

«Амур-1650» — еще один экспортный вариант. Имеет шумопеленгаторную антенну, способную обнаруживать очень малошумные цели, может дать залп из шести ракет.

представители

Б-585 «Санкт-Петербург» — находится в опытной эксплуатации до 2016 года

Б-586 «Кронштадт» — до середины 2012 года строительство остановлено и возобновлено только 07.09.2013

Б-587 «Великий Лука» — лодка перезаложена 19 марта 2015 года

Тактико-технические характеристики подводных лодок 677 «Жигули»

тип корабля……………..многоцелевые дизель-электрические подводные лодки
Скорость (в надводном положении)……………..10 узлов
Скорость (подводная)… …………..21 узел
Рабочая глубина……………..250 м
Предел погружения……………..00 м
Автономность……………..45 (30 для «Амур-950» ) сутки
Экипаж……………..35 (21 для «Амур-950») человек
Водоизмещение надводное……………..1 765 (1 150) т
Водоизмещение подводное……………. .н/д
Длина наибольшая (по КВЛ)……………..66,8 (58,8) м
Ширина шкафа наиб………………7,1 (5,65) м
Силовая установка ГЭУ с полным электродвижением…….ДВ с двигателями Д49; ВНЭУ на ТЭ (в перспективе)
Торпедно-минное вооружение……. 6 ТА калибра 533 мм, 18 (16) торпедных ходов-80К, до 44 мин
Ракеты……АСМ 10 РК ракет П-800 «Оникс» и/или «Калибр»
МЛП……………..ПУ ПЗРК «Игла-1М», 6 РП в ТПК

Подводный катер пр.677 «Жигули» – фото с парада в Санкт-Петербурге

А источник

Одномолекулярный FRET с высоким разрешением посредством обмена ДНК (ЛАД X)

  • Список журналов
  • Выбор автора ACS
  • PMC8050827

Нанобуквы

Нано Летт. 2021 14 апреля; 21(7): 3295–3301.

Опубликовано в сети 19 марта 2021 г.. doi: 10.1021/acs.nanolett.1c00725

Информация об авторе Примечания к статье Информация об авторских правах и лицензиях Отказ от ответственности

Дополнительные материалы

Одномолекулярный FRET универсальный инструмент для изучения нуклеиновых кислот и белки в нанометровом масштабе. Однако в настоящее время только пара пар FRET могут быть надежно измерены на одном объекте, что делает сложно применять одномолекулярный FRET для структурного анализа биомолекул. Здесь мы представляем подход, который позволяет определение нескольких расстояний между парами FRET в одном объект. Мы используем программируемое временное связывание между короткими цепями ДНК. для определения эффективности FRET нескольких пар флуорофоров. Позволяя только одна пара FRET должна быть сформирована одновременно, мы можем определить расстояние между парами с субнанометровой точностью. Расстояние между др. пары определяются путем последовательного обмена цепями ДНК. Мы называем этот подход к мультиплексированию FRET X для FRET посредством обмена ДНК. Наш ЛАД Технология X станет инструментом для анализа биомолекул с высоким разрешением и наноструктуры.

Ключевые слова: Одномолекулярный FRET, структурная биология, ДНК нанотехнологии, DNA-PAINT, мультиплексирование одиночных молекул

Рентгеновская кристаллография, ядерный магнитный резонанс и криоэлектронный микроскопия является золотым стандартом для определения структуры биомолекулы. 1,2 Тем не менее, незначительные конформационные изменения биомолекул часто невозможно наблюдать с помощью этих методов. поскольку определенная конформация может быть стабилизирована требуемым образцом подготовка. 3 Одномолекулярная банка FRET использоваться для определения строения молекул, включая редкие конформации, с субнанометровым разрешением. Однако использование одиночных молекул FRET для анализа сложных молекулярных структур, например, третичных структур белка, было ограничено, так как оно требует разрешения эффективность FRET нескольких пар красителей. 4,5 В настоящее время одномолекулярный FRET-анализ позволяет нам иметь дело только с одним или двумя Пары FRET в одном измерении. 6,7 Следовательно, структурный анализ с использованием одиночной молекулы FRET требует подготовки белковой библиотеки, состоящей из множества различных комбинаций расположение красителей, тщательное моделирование и симуляции на основе данных приобретение. 8−11

Мультиплексирование одиночных молекул было продемонстрировано с фотопереключаемыми флуорофоры. В этом подходе интересующая молекула помечается с одним донором и несколькими идентичными акцепторными флуорофорами. При использовании фотопереключаемых акцепторных флуорофоров только один из акцепторов активен в данный момент времени. 12 Этот метод, называемый переключаемым FRET, позволяет обнаруживать несколько FRET пар в одном нанообъекте и, таким образом, определение структуры внутри и взаимодействия между биомолекулами, начиная от белков к ДНК. Однако стохастический характер фотопереключения является одним из основных препятствий для широкой адаптации метода. Альтернативный способ переключения между состояниями включения и выключения флуоресцентного зондов заключается в использовании флуорофоров, которые связываются с мишенью только на короткое время. период времени, как при накоплении точек в наноразмерной топографии (КРАСКА). 13−15 Например, флуорофоры прикрепляются к короткой ДНК олигонуклеотиды, которые связывают комплементарные нити-мишени на протяжении нескольких сотен миллисекунд. Эта временная привязка играет центральную роль в сверхразрешении. метод накопления точек на основе ДНК для визуализации в наноразмерной топографии (ДНК-КРАСКА). 16−19

Здесь мы предлагаем новый инструмент структурного анализа, который может решить эффективность FRET нескольких пар в одной молекуле-мишени. Используя программируемое временное связывание между короткими цепями ДНК, в любой момент времени формируется одна пара FRET, что позволяет точно определение расстояния между моментально образованным флуорофором пара. Повторяя цикл визуализации, мы можем решить несколько точек интереса (POI) в одном наноразмерном объекте. Мы демонстрируем доказательство концепции одномолекулярного структурного разрешения субнанометрового анализ различных наноструктур ДНК.

Для демонстрации концепцию FRET через нити ДНК мы разработали анализ, в котором акцепторная (Cy5) меченая одноцепочечная (ss) ДНК молекулу иммобилизовали на кварцевом предметном стекле через биотин-стрептавидин сопряжение (А). Измерения дали отчетливый сигнал флуоресценции в одиночных молекулах. изображения микроскопии тотальной внутренней рефракции при связывании меченого донором нити имиджера на иммобилизованной нити-мишени (B). Базовая последовательность и длина имидж-сканера последовательность цепи выбирали таким образом, чтобы события связывания между две нити ДНК будут иметь короткое время пребывания, чтобы обеспечить частые пополнение нити имидж-сканера (B, C и дополнительная фигура 1A) и, таким образом, одна и та же точка интереса должна быть исследована несколько раз. раз. 20 При этом время выдержки был выбран достаточно длинным, несколько сотен миллисекунд или дольше (Дополнительный рисунок 1), для точного определения эффективности FRET.

Открыть в отдельном окне

Повторяющееся связывание коротких нитей имидж-сканера ДНК допускает высокие точность обнаружения для одномолекулярного FRET. (А) Схематическое изображение одномолекулярного FRET-анализа. Акцептор (Cy5, красная звезда), помеченный Одноцепочечная ДНК-конструкция-мишень иммобилизована на пегилированном поверхности через биотин-стрептавидиновую конъюгацию. Привязка донорная (Cy3, зеленая звездочка) нить имидж-сканера дает короткие События FRET и наблюдают с помощью микроскопии полного внутреннего отражения. (B) Серия снимков ПЗС, полученных из фильма с одной молекулой с выдержкой 100 мс. Верхний ряд представляет донорский канал, а нижний ряд представляет акцепторный канал. Каждая точка представляет одна молекула. Можно наблюдать динамическое связывание нитей имидж-сканера со временем (выделенная молекула). (С) Схематическое изображение конструкции оцДНК. После связывания нити имиджера донор флуорофор отделен от акцептора тиминовым линкером из 25 нуклеотидов. (D) Кимограф FRET одной молекулы из временной трассы от одного одиночного молекула (ROI, выделенная молекула из B). Кимограф показывает эффективность FRET для каждой точки данных в событии привязки (синие линии) и среднее значение FRET эффективность по всем точкам данных на событие привязки (точки) как функция времени. Гистограмма FRET, построенная на основе эффективности для каждого точка данных (D, средняя панель) имеет большее стандартное отклонение (0,72 ± 0,05) по сравнению со стандартным отклонением (0,72 ± 0,01) от гистограммы который построен из средних значений FRET на события связывания (D, нижняя панель).

Для визуализации эффективности FRET каждой пары красителей появление в одной области интереса (ROI, выделена желтыми кружками на B), мы построили FRET кимограф (D и дополнительная фигура 2A). Кимограф показывает эффективность FRET на точку данных (D, линии) и среднюю эффективность FRET из все точки данных на событие привязки (D, точки). Гистограммы, построенные с помощью FRET эффективность по точкам данных (D, средняя панель) и по событию связывания (D, нижняя панель) показывает один Популяция FRET, что указывает на то, что связывание имидж-сканера является высокоспецифичным. на целевой сайт. Ансамбль кимографа, построенный из всех 363 молекул для этой конструкции показано аналогичное среднее значение FRET и стандартное отклонение 0,71 ± 0,01 (дополнительная фигура 2B).

Анализ сложных биомолекул с использованием одиночной молекулы FRET требует обнаружение нескольких пар FRET в одном объекте. Один из основные преимущества FRET с использованием нитей ДНК по сравнению с обычными измерениями FRET заключается в использовании временно связывающейся нити имиджера ДНК, которая может быть заменена по желанию. Каждая POI помечена ортогональной последовательностью для имидж-сканера. связывание может быть отобрано без каких-либо перекрестных помех с помощью раствора обмен. Отсутствие перекрестных помех между POI позволяет точно определение эффективности FRET каждого POI. Чтобы проиллюстрировать это, мы разработали конструкцию оцДНК с двумя целевыми последовательностями, каждая из которых может взаимодействовать с донорно-меченой нитью имиджера в течение 2–3 с, давая разная эффективность FRET (A и дополнительный рисунок 1A, B). Расстояние между POI B и приемником остается неизменным в течение обе конструкции (35 нуклеотидов), но расстояние для POI A изменяется среди конструкции (20 нуклеотидов для B, G и 25 нуклеотидов для C, H). Когда мы использовали один и тот же имидж-сканер цепь для обоих POI, разделенных спейсером из 5 нуклеотидов (B), наблюдались два пика FRET (Д), отчетность о местоположении каждого POI. Однако, когда две POI были размещены без промежуточной последовательности линкера (C) гистограмма FRET стала неразрешимой (Е). Эти результаты показывают, что невозможно определить пару расстояния до нескольких POI с высокой точностью с использованием одного тепловизора прядь. Следует отметить, что мы использовали экспериментальные условия для проверки разрешающую способность нашего подхода за счет структурного уплотнения целевая молекула оцДНК, помещенная в буфер с высокой ионной силой, 100 мМ MgCl 2 (дополнительный рисунок 3).

Открыть в отдельном окне

FRET путем обмена уникальными нитями имидж-сканера позволяет получить высокое пространственное разрешение нескольких POI в одном нанообъекте. (А) Схема представление одномолекулярных экспериментов с двумя мишенями последовательности. Используется одна нить имиджера, которая может связываться с обоими POI в молекуле-мишени. Акцептор (Cy5, красный кружок), помеченный Конструкция оцДНК содержит две POI. Связывание донора (Cy3, зеленый кружок) помеченная нить имидж-сканера приводит либо к высокому FRET (при связывании к POI A) или средний FRET (при привязке к POI B). (B,C) Схематическое изображение целевых конструкций, в которых две POI разделены 5-тиминовым компоновщик (панель B) или в котором два POI напрямую подключены к друг друга (панель С). Расстояние от акцептора сохранялось то же самое для POI B (35 нуклеотидов) среди двух конструкций, но было изменено для POI A (20 нт для панели B и 25 нт для панели C). (D) Одиночная молекула кимограмма целевой конструкции одноцепочечной ДНК с панели B. На верхней панели показаны события связывания, полученные для всех молекул в одном поле Посмотреть. На нижней панели показана гистограмма FRET, состоящая только из донора. пик и два дополнительных пика FRET, сообщающие о местоположении каждого POI по отношению к акцепторному флуорофору. (E) Одиночная молекула кимограмма целевой конструкции оцДНК с панели C. Используя тот же Нить имидж-сканера для обеих POI не позволяет обнаружить положение обеих POI, когда они находятся в непосредственной близости. Гистограмма FRET показывает широкий пик на уровне 0,81. (F) Схематический рабочий процесс FRET от eXchange нити имиджера (или FRET X). Целевые конструкции оцДНК состоят из два POI с уникальными последовательностями связывания ДНК, что позволяет нам измерять POI по одной. В первом раунде обнаружения имидж-сканер прядь для POI B (синие кружки) добавляется и отображается в течение 5 мин. затем микрожидкостная камера промывается и нить имидж-сканера для POI A (оранжевые кружки). (G, H) Схематическое изображение FRET X целевых конструкций, в которых две уникальные последовательности POI отмечены синими кружками (POI B) или оранжевые кружки (POI A) разделены 5-нуклеотидным тимином компоновщик (панель G) или в котором две POI находятся непосредственно рядом (панель ЧАС). (I,J) Кимографы одиночных молекул для FRET X для конструкций на панелях G и H. Изображение FRET X позволяет определить каждый POI в отдельном раунде. В первом раунде визуализации FRET X мы наблюдаем аналогичная эффективность FRET для POI B, 0,76 ± 0,05 (панель I) и 0,75 ± 0,01 (панель J). (K,L) Одномолекулярные кимографы для второй раунд визуализации FRET X конструкций на панелях G и H. (K) Для конструкции, в которой POI были разделены 5-нуклеотидным тимином линкера мы наблюдали эффективность FRET, которая приводила к эффективности FRET 0,87 ± 0,02 для POI A. (L) FRET X позволяет точно обнаружение POI, даже когда они находятся в непосредственной близости. Мы наблюдали отчетливый пик FRET во втором раунде визуализации FRET X для POI A 0,81 ± 0,02 (панель L) и может быть четко отделен от POI А (панель J, 0,75 ± 0,02). (M,N) Гауссовы подгонки отдельных гистограммы для каждой POI, полученные с использованием подхода FRET X, позволяют для определения центра пика с точностью <0,005. Центры пиков нанесены на отдельную панель, которую мы назовите это FRET-отпечатком наноразмерного объекта. Средняя эффективность FRET и стандартное отклонение вычисляются из трех независимых экспериментов.

Для достижения более высокого пространственного разрешения мы искали для обнаружения различных POI независимо друг от друга, чтобы можно было получить перекрывающиеся пики FRET. отдельно и подогнан более точно. Как показано на F, каждая POI измерялась с использованием уникальная короткая цепь ДНК-визуализатора. После записи событий привязки для первого POI в течение нескольких минут была заменена нить тепловизора путем промывки микрожидкостной камеры и введения уникального устройства для визуализации ДНК нить для второго POI (F). Этот процесс можно повторять для любого количества POI. Мы называем этот метод FRET X для FRET через обмен ДНК.

Чтобы продемонстрировать концепцию FRET X, мы измерили POI, разделенные с помощью 5-нуклеотидного тиминового (G) линкера и POI в непосредственной близости без линкера между ними (H) используя два уникальные нити тепловизора. В случае линкера из 5 нуклеотидов в первом раунде обнаружения FRET X мы определили, что пик FRET составляет 0,76 для POI B (I). Во втором раунде визуализации FRET X с использованием комплементарной нити имиджера. к POI A мы наблюдали один пик FRET при 0,87, сообщая о Точка интереса А (К). Как показано на рисунках J,L, FRET X позволяет точно обнаруживать обе точки интереса, даже если они находятся в непосредственной близости. Отметим, что конформация частично гибридизованная нить шаблона отличается между панелями D, E и панелями I – L из-за разницы в последовательности незанятого связывания сайте, что, следовательно, приводит к несколько разной эффективности FRET.

Наш метод FRET X позволяет обнаруживать только один POI в течение длительного времени, пока не будет введена другая нить имиджера. Следовательно, в то время как каждая гистограмма показала широкое распределение ∼0,05 (I,J, стандартное отклонение) пика, аппроксимация по Гауссу может быть использована для разрешения центр пика с высокой точностью <0,005 (стандартная ошибка среднего), где достижимая точность зависит от количества события связывания (дополнительная фигура 4A, B). Разрешенные значения FRET для каждой точки интереса отображаются как FRET. отпечаток измеряемого объекта (M,N).

Структурный анализ сложных биомолекулы с использованием одиночных молекул FRET требует обнаружения нескольких пар FRET в одном объекте. Чтобы продемонстрировать потенциал FRET X, мы разработали наноструктуру ДНК. состоящий из двух POI и проверенный, может ли FRET X получить расстояние информация для каждой POI в одном объекте. Наноструктура ДНК имеет треугольную форму, состоящую из контрольной точки акцептора, и POI размещаются в каждом углу треугольника (A). Во избежание фотообесцвечивания акцепторного красителя мы разработали уникальную последовательность вблизи 3′-конца конец конструкции, где комплементарный меченый акцептор имиджер прядь может временно связываться. Увеличить вероятность энергии перенос между донорными и акцепторными флуорофорами, акцепторный имиджер нить была разработана, чтобы иметь более высокую скорость связывания и более низкую диссоциацию скорость, чем нити донора имидж-сканера. 21,22 Мы оценили зависящие от времени скорости обнаружения FRET как для статических, так и для динамических акцепторная нить. Статический акцептор показал более быстрое снижение Скорость обнаружения FRET из-за фотообесцвечивания (дополнительная фигура 6).

Открыть в отдельном окне

Структурный анализ сложной наноструктуры ДНК с использованием ЛАД Х. (A) Схематическое изображение наноструктуры двухцепочечной ДНК, используемой для определение нескольких POI в одной молекуле. Наноструктура ДНК состоят из 2 POI, одна из которых зафиксирована (POI A, синие кружки) на 15 п.н. от сайта связывания акцепторного имиджера. Второй POI (POI B, оранжевые кружки) отделены линкером разной длины от акцептор. Цепь имиджера, меченная акцептором (Cy5), временно связывается к уникальному сайту связывания (красные кружки), чтобы избежать фотообесцвечивания акцепторный флуорофор. (B) Гистограммы FRET X различных POI в наноструктуре ДНК. Для наноструктуры ДНК с линкером длиной 13 п.н. между POI B и акцептором мы наблюдаем эффективность FRET 0,31 ± 0,01 и 0,47 ± 0,02 для POI A и POI B соответственно (В, верхний ряд). Затем, только уменьшая длину линкера с шагом 1 п.н. между POI B и акцептор, мы наблюдали увеличение эффективности FRET для POI B (0,52 ± 0,01 и 0,60 ± 0,02 для 12-пн и 11-пн, соответственно). Кроме того, эффективность FRET для POI A и акцептор увеличивается, когда линкер между POI B и акцептором короче, что указывает на глобальное искажение наноструктуры из-за укорочения одной стороны треугольника (левая панель). (C) Средняя эффективность FRET X для POI A (светлые кружки) и POI B (закрашенные кружки), определенных на разных дней. Рассчитываются средняя эффективность FRET и стандартное отклонение. из трех независимых экспериментов. (D) Схематическое изображение наноструктура двухцепочечной ДНК с тремя POI. Третий POI добавлен близко к сайту связывания акцептора. (E) Кимограммы, полученные для каждой POI наноструктуры двухцепочечной ДНК. В первом раунде визуализации FRET X мы наблюдали эффективность FRET 0,27 ± 0,01 для POI A. Второй раунд визуализации FRET X привел к эффективности FRET 0,47 ± 0,02 для POI B. В последнем раунде визуализации FRET X мы наблюдали Эффективность FRET 0,86 ± 0,01 для POI C в наноструктуре ДНК. Средняя эффективность FRET и стандартное отклонение рассчитываются по формуле три независимых эксперимента.

В первом раунде FRET X мы определили эффективность FRET для POI A, который отделен от акцептора линкером длиной 15 пар оснований и наблюдается отчетливый пик FRET при 0,31 (B, верхняя левая панель). Далее промываем патронник и вводили нить имидж-сканера для POI B и наблюдали пик FRET при 0,47 когда POI B находится на расстоянии 13 п.н. от акцептора (B, верхняя правая панель).

Для определения разрешение FRET X для обнаружения множественных POI в наноразмерном объекте, мы изменили длину между акцептором и POI B с шагом 1 п.н. Для каждой конструкции мы определили Эффективность FRET для обеих POI и наблюдалось явное изменение FRET для POI B (B, правые панели и C, сплошные кружки). Кроме того, эффективность FRET для POI A и акцептор увеличивались, когда линкер между POI B и акцептором был короче (B, левые панели и C, незаштрихованные кружки).

Для дальнейшей демонстрации способности FRET X для обнаружения из нескольких POI мы добавили третью POI в треугольную структуру ДНК (Д). POI C был введен в месте, близком к реперной точке акцептора, и дает высокое значение FRET (E, правая панель). Для POI A и B мы наблюдали аналогичные Эффективность FRET по сравнению с их расположением в структуре с только две POI (E левая и средняя панели и B верхние панели).

Чтобы исследовать окончательное разрешение FRET X, мы разработали серия конструкций оцДНК, в которых положение донорского имиджера сайт связывания изменяется только одним нуклеотидом среди различных пряди имидж-сканера (A). Затем цикл FRET X повторяли для всех девяти цепей имидж-сканера. Центр пика каждой гистограммы определяли подгонкой единая функция Гаусса. Полученный отпечаток пальца показал девять отдельных пики, по одному для каждого меченого донором нуклеотида (B и дополнительная фигура 5), что указывает на то, что FRET X имеет разрешение в один нуклеотид.

Открыть в отдельном окне

Одноместный разрешение нуклеотидов может быть достигнуто с помощью FRET X. (A) Схема представление одномолекулярных конструкций, используемых для определения различных POI, разделенных одной парой оснований. Акцептор (Cy5, красный кружок) помеченная цельная конструкция оцДНК, состоящая из 9-нуклеотидной мишени последовательность (оранжевые кружки), где каждая нить имидж-сканера может связываться. Серия донорных (Cy3, зеленые кружки) нитей, помеченных FRET X imager. Позиция каждого POI (или нуклеотида) в целевой последовательности будет определяться один за другим, используя наш подход FRET X. (B) Стандартная ошибка FRET Эффективность X для нити 5 имидж-сканера (дополнительная фигура 5E) по сравнению с количеством событий связывания. Мы наблюдаем что мы можем определить центр аппроксимации Гаусса с точностью FRET X Δ E ~ 0,01 после >10 событий связывания. (C) Средняя эффективность FRET X для каждого из POI, определенная на разные дни. Мы находим хорошую воспроизводимость для FRET X. Среднее значение FRET эффективность и стандартное отклонение рассчитываются по трем независимым эксперименты.

Чтобы определить точность, можно получить с помощью нашего FRET X подход, стандартная ошибка эффективности FRET была построена в зависимости от событий привязки числа. Выбранные события были из нити имидж-сканера, помеченной в положении 5 (дополнительная фигура 5E), что дало значение эффективности FRET 0,65. Данный наша скорость счета фотонов 5000 с –1 и привязка время пребывания 2 с (дополнительный рисунок 1A), мы ожидаем, что теоретический предел 23 точность определения FRET составляла ~ 0,005 (дополнительная фигура 4C, D). Экспериментально, однако, мы обнаружили, что центр гауссовой подгонки можно определить с помощью точность Δ E ∼ 0,01 после получения >10 событий связывания (B) из-за других источников шума, таких как электронный выстрел шум и фон, рассеянный свет и неравномерный профиль освещения. Воспроизводимость FRET X была продемонстрирована путем измерения всех девяти маркированные нити имидж-сканера в разные дни. Как показано на C, стандартное отклонение между измерения, сделанные в разные дни, составляет около 0,02 для каждой конструкции.

Наконец, анализ различных POI с высоким разрешением в нанообъекте без проблем фотообесцвечивания, мы предположили, что FRET X можно надежно использовать для анализа популяций на уровне одной молекулы. уровень, который требует многократного отбора проб отдельных целей. К продемонстрировать потенциальное использование FRET X для анализа населения в на уровне одной молекулы мы разработали две конструкции оцДНК со структурными различия и проверили, можно ли различить отдельные молекулы когда они смешаны. Конструкции оцДНК состоят из двух POI, один из которых расположен в идентичном положении на двух конструкциях ДНК. Второй POI соединен со стороной одного из нуклеотидов в основной последовательности и имеет различное расположение на двух конструкциях (А и дополнительные рисунки 7 и 8). Чтобы избежать фотообесцвечивания акцепторного красителя, мы разработали уникальную последовательность вблизи 3′-конца конструкции, где комплементарный акцептор меченая нить имиджера может временно связываться. Мы иммобилизовали смесь двух конструкций в соотношении 1:1.

Открыть в отдельном окне

Популяционный анализ по индивидууму молекулярный уровень с использованием FRET X. (A) Схематическое изображение конструкций ДНК, используемых для популяции анализ. Конструкция ssDNA содержит две POI, одна из которых фиксированная. и имеет одинаковое расположение относительно акцептора на обеих конструкциях. Вторая POI связана с боковой цепью одного из нуклеотидов. в основной последовательности и имеет различное расположение на обеих конструкциях. (B,C) Кимограммы отдельных молекул, полученные для равной смеси конструкций оцДНК, иммобилизованных на предметном стекле. ЛАД X цикл состоял из трех раундов. В первом раунде FRET X цикла, мы определили уникальный отпечаток POI A среди различных конструкции и наблюдают эффективность FRET 0,94 для высоких ладов панель конструкции B, левая панель) и 0,63 для конструкции Medium-FRET (панель С, левая панель). Результатом стал второй раунд цикла FRET X. в одном пике, полученном из FRET между POI B и акцептором, который идентичен в обеих конструкциях (панели B, C, средние панели). В последнем раунде цикла FRET X (панели B, C, правые панели) мы подтвердили местоположение POI A и наблюдали те же пики FRET, что и в раунде 1. (D, E) Гистограммы, показывающие доли совпадений отпечатков пальцев и несовпадения отдельных молекул, которые были идентифицированы как высокоактивные. (панель D) или конструкция Medium-FRET (панель E). Мы определили среднее FRET-эффективность отпечатка среднего или высокого уровня FRET в раунде 1 и сравнил это с неопределенностью обнаружения Δ E ∼ 0,07 с третьим раундом, чтобы найти положительные совпадения. Большинство молекул были идентифицированы одинаково между раундами 1 и 3, для конструкции FRET ssDNA с высоким (панель D) и средним (панель E) FRET.

В первом раунде FRET X мы определили FRET эффективность для POI A и наблюдал две отдельные популяции FRET, сообщающие о четкое расстояние между POI A и контрольной точкой акцептора для две разные конструкции (B, C, левые панели). Далее мы промыли микрожидкостную камеру и ввели нить имидж-сканера для POI B. Как и ожидалось, мы наблюдал один пик для POI B, сообщая о том же положении POI B для обеих конструкций (B, C, средние панели). В финальном раунде FRET X мы подтвердил местоположение POI A, введя нить имидж-сканера для POI A назад и наблюдал те же пики FRET, что и на изображении FRET X. 1 тур (В,С, правые панели).

Для каждой отдельной молекулы мы определили средняя эффективность FRET для POI A в раунде 1 и 3 сравнил это с эффективностью FRET получено для POI A в раунде 3 (дополнительная фигура 9). Большинство (>80%) отдельных молекул в смесь имела аналогичную разрешенную эффективность FRET POI A между раундами 1 и 3 для конструкций FRET с высоким (D) или средним (E) значением. Только небольшая часть молекул не показывать совпадение между раундами FRET X из-за другого разрешения Эффективность FRET для POI A или отсутствие событий связывания нитей имидж-сканера (Д и Е). В целом, эти результаты показывают, что метод FRET X способен обнаружение популяций отдельных конструкций ДНК на одномолекулярных уровень.

Здесь мы представляем доказательство концепции для FRET X, новый инструмент для обнаружение нескольких пар FRET в одном объекте, что может использоваться для структурного анализа биомолекул. Наша техника FRET X основан на динамическом связывании коротких олигонуклеотидов с флуоресцентной меткой. к дополнительным последовательностям стыковки на целевом объекте. Общепринятый одномолекулярные методы FRET сообщают об изменениях расстояния между одной парой красителей на одной молекуле. Напротив, FRET X использует ортогональные нити имидж-сканера для разных POI, что позволяет нам разделить обнаружение во времени и, следовательно, обнаружить большое количество POI на одном объекте. Оба переключаемых FRET и FRET X использовать стохастический метод включения-выключения. Однако, в отличие от переключаемого FRET, FRET X позволяет зондировать одно и только одно место в течение длительного времени. время, пока оператор не введет другую нить имидж-сканера. Следовательно, мы можем собирать данные с более высокой точностью для каждого местоположения. Мы отмечаем, что наша техника FRET X может быть интегрирована с другой недавно разработанной мультиплексный метод штрих-кода FRET, 24 который позволяет одновременно наблюдать за несколькими ортогональными датчиками, уменьшая общее время измерения.

Одномолекулярный FRET недавно в сочетании со сверхвысоким разрешением визуализация с использованием DNA-PAINT для более быстрого сбора данных 21,25 и мультиплексирования на основе эффективности FRET. 22 В то время как FRET X предназначен для предоставления информации о положении и расстоянии на разных POI в одном объекте, мы предполагаем, что он также может использоваться для улучшения разрешения существующих технологий DNA-PAINT.

Благодарим Викторию Глобите и Раман ван Ви для критическое чтение и обратная связь. Благодарим Мишу Кляйна за помощь в программное обеспечение для анализа. CJ был поддержан Vrije Programma (SMPS) Фонд фундаментальных исследований материи и человеческих границ Научная программа (RGP0026/2019).

Дополнительная информация доступна бесплатно по адресу https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.1c00725.

  • Рисунки, показывающие кинетику нитей имидж-сканера FRET X, теоретический и практический предел FRET X, а также все материалы и методы, включая последовательности ДНК, используемые для экспериментов с одной молекулой (PDF)

М. Ф. и С.Дж. инициировал и разработал проект. М.Ф. и Ш.Х.К. выполнил эксперименты. Ш.Х.К и И.С. написал программное обеспечение для анализа. М.Ф., Ш.Х.К., и CJ проанализировали и обсудили данные. М.Ф. и CJ написали рукопись. Все авторы прочитали и улучшили рукопись.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующие финансовые интересы.

nl1c00725_si_001.pdf (34M, pdf)

  • Ши Ю. Проблеск структурной биологии с помощью рентгеновской кристаллографии. Клетка 2014, 159, 995–1014. 10.1016/j.cell.2014.10.051. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Nogales E.; Шерес S.H.W. Крио-ЭМ: уникальный инструмент для визуализации макромолекул Сложность. Мол. Клетка 2015, 58, 677–689. 10.1016/j.molcel.2015.02.019. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Henzler-Wildman K.A.; и другие. Внутренние движения вдоль траектория ферментативной реакции. Природа 2007, 450, 838–844. 10.1038/природа06410. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
  • Алгар В. Р.; Хильдебрандт Н.; Фогель С.С.; Мединц И. Л. FRET как биомолекулярный исследовательский инструмент — понимание его потенциала, избегая подводные камни. Нац. Методы 2019, 16, 815–829. 10.1038/с41592-019-0530-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Лернер Э.; и другие. К динамичной структурной биология: Два десятилетия одномолекулярных Ферстеровский резонансный перенос энергии. Наука (80-.). 2018, 359. 10.1126/science.aan1133. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Hohng S.; Джу С .; Шляпа. Одномолекулярный Трехцветный лад. Биофиз. Дж. 2004, 87, 1328–1337. 10.1529/биофиз.104.043935. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Clamme J. P.; Дениз А. А. Трехцветная одиночная молекула флуоресцентный резонанс передача энергии. ХимФизХим 2005, 6, 74–77. 10.1002/cphc.200400261. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Калинин С.; и другие. Инструментарий и тест исследование для FRET-фиксации высокой точности структурное моделирование. Нац. Методы 2012, 9, 1218–1225. 10.1038/nmeth.2222. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Хелленкамп Б.; Вортманн П.; Кандзя Ф.; Захариас М.; Хьюгель Т. Многодоменная структура и коррелированные динамика, определяемая самосогласованным сети ФРЕТ. Нац. Методы 2017, 14, 176–182. 10.1038/nmeth.4081. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Пеулен Т. О.; Опанасюк О.; Зайдель C.A.M. Сочетание графического и аналитического Методы молекулярного моделирования для анализа измерений FRET с временным разрешением меченых макромолекул точно. Дж. Физ. хим. Б 2017, 121, 8211–8241. 10.1021/acs.jpcb.7b03441. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Craggs TD; Капанидис А. Н. На шесть шагов ближе к структурной биологии, основанной на FRET. Нац. Методы 2012, 9, 1157–1159. 10.1038/nmeth.2257. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
  • Апхофф С.; и другие. Мониторинг нескольких расстояний в пределах одной молекулы с помощью переключаемых ЛАД. Нац. Методы 2010, 7, 831–836. 10.1038/nmeth.1502. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Джанноне Г.; и другие. Динамическое сверхразрешение визуализация эндогенных белков на живых клетки сверхвысокой плотности. Биофиз. Дж. 2010, 99, 1303–1310. 10.1016/j.bpj.2010.06.005. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Schoen I.; Рис Дж.; Клотч Э.; Эверс Х.; Фогель В. Связывание-активируется локализационная микроскопия ДНК л. Нано Летт. 2011, 11, 4008–4011. 10.1021/nl2025954. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Шаронов А.; Хохштрассер Р. М. Широкое поле субдифракционная визуализация по накопленному связыванию диффузионных зондов. проц. Натл. акад. науч. США. 2006, 103, 18911–18916. 10.1073/пнас.0609643104. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Jungmann R. Супер-разрешение Микроскопия с помощью флуоресцентной визуализации переходного связывания на ДНК-оригами. Nano Lett. 2010, 10, 4756–4761. 10.1021/nl103427w. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
  • Юнгманн Р.; и другие. Мультиплексная трехмерная визуализация клеток со сверхвысоким разрешением с помощью DNA-PAINT и Обмен-КРАСКА. Нац. Методы 2014, 11, 313–318. 10.1038/н-мет.2835. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Dai M.; Юнгманн Р.; Инь П. Оптическая визуализация отдельных биомолекул в плотно упакованных скоплениях. Нац. нанотехнологии. 2016, 11, 798–807. 10.1038/ннано.2016.95. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Schnitzbauer J.; Штраус М. Т.; Шлихтарле Т.; Шудер Ф.; Юнгманн Р. Супер-разрешение микроскопия с помощью DNA-PAINT. Нац. протокол 2017, 12, 1198–1228. 10.1038/нпрот.2017.024. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Филиус М.; и другие. Высокоскоростное супер-разрешение Визуализация с использованием белковой ДНК-КРАСКИ. Нано лат. 2020, 20, 2264–2270. 10.1021/acs.nanolett.9b04277. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Auer A. ; Штраус М. Т.; Шлихтарле Т.; Юнгманн Р. Быстро, без фона Визуализация DNA-PAINT с использованием зондов на основе FRET. Нано лат. 2017, 17, 6428–6434. 10.1021/acs.nanolett.7b03425. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
  • Дойснер-Хельфманн Н. С.; и другие. Корреляционная одномолекулярная визуализация FRET и DNA-PAINT. Нано Летт. 2018, 18, 4626–4630. 10.1021/acs.nanolett.8b02185. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Holden S. J.; и другие. Определение пределов одномолекулярного FRET разрешение в TIRF-микроскопии. Биофиз. Дж. 2010, 99, 3102–3111. 10.1016/j.bpj.2010.09.005. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Kim S. H.; Ким Х .; Чон Х .; Юн Т.-Ю. Кодирование нескольких виртуальных сигналов в штрих-кодах ДНК с одномолекулярным FRET. Нано лат. 2021, 21, 1694–1701. 10.1021/acs.nanolett.0c04502. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Lee J.; Парк С.; Хонг С. Ускоренная микроскопия FRET-PAINT. Мол. Мозг 2018, 11, 70. 10.1186/с13041-018-0414-3. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Биосенсор FRET позволяет проводить пространственно-временные наблюдения за вызванной сдвиговым напряжением полярной активацией RhoGDIα

Введение

Миграция клеток — сложный процесс, регулируемый физическими и химическими факторами, играющий значительную роль в различных физиологических и патологических событиях, особенно при метастазировании опухоли 1 . До того, как может произойти миграция клеток, концентрации соответствующих факторов распределяются пространственно асимметрично, что называется клеточной полярностью 2 . Эта картина распределения указывает направление миграции и метастазирования опухоли 3 . Решающим фактором, способствующим установлению клеточной полярности, являются GTPases Rho-семейства, которые регулируют образование ламеллиподий и перестройку цитоскелета 4 . Ингибитор Rho GDP-диссоциации α (RhoGDIα), также известный как RhoGDI1, является основным членом семейства RhoGDI, экспрессируется повсеместно 5 и участвует в цикле Rho между формой, связанной с GTP (активное состояние, на мембране), и формой, связанной с GDP (неактивное состояние, в цитоплазме) 6 . Устойчивое состояние GDP-связывающих Rho ГТФаз в цитозоле связано с RhoGDIα, образующим комплекс RhoGDIα-Rho ГТФаз. Комплекс перемещается на плазматическую мембрану при активации факторами обмена Rho-гуаниновых нуклеотидов (Rho GEF), а затем комплекс диссоциирует. После выполнения своих функций неактивные Rho GTPases будут извлечены из мембраны с помощью RhoGDIα 9.0261 7 .

На сегодняшний день в большинстве работ RhoGDIα рассматривается просто как негативный регулятор Rho GTPases, игнорируя его собственный механизм активации 8,9 . Фактически, ингибирование экспрессии RhoGDIα может способствовать инвазии и метастазированию клеток рака молочной железы и стволовых клеток трофобласта 10,11 , но избыточная экспрессия в клетках гепатомы имеет аналогичный эффект 12,13 . Более того, в некоторых сообщениях доказано, что RhoGDIα может быть опосредован другими молекулами. Например, семейство белков ezrin-radixin-moesin (ERM) может напрямую связывать RhoGDIα с высвобождением Rho GTPases 9. 0261 14 , и плексин-B3, рецептор клеточной поверхности семафорина 5A, может временно взаимодействовать с RhoGDIα, способствуя экстракции Rac-GTP из RhoGDIα в цитоплазму 15 . Некоторые киназы могут даже фосфорилировать несколько аминокислотных сайтов RhoGDIα напрямую, чтобы повлиять на процесс образования комплекса RhoGDIα-Rho GTPases 16,17 . Эти данные указывают на то, что должен существовать путь регуляции RhoGDIα напрямую, игнорируемый, но важный и независимый от Rho GTPases.

Однако, поскольку Rho GTPases могут осуществлять свою регуляцию RhoGDIα 9 , а RhoGDIα может играть свою роль только в сочетании с Rho GTPases, что можно рассматривать как активацию RhoGDIα из-за его функции ингибирования активации Rho GTPases, Отсутствие эффективного инструмента затрудняет наблюдение активации RhoGDIα при его связывании с Rho GTPases в живых клетках. В этом исследовании мы разработали биосенсор с использованием переноса энергии флуоресцентного резонанса (FRET) и проверили его способность определять уровни связывания RhoGDIα и Rho GTPase в живых клетках, избегая при этом эффекта Rho GTPases. Мы построили пространственно-временную модель распределения степени связывания комплекса RhoGDIα-Rho GTPases в живых клетках HeLa и проанализировали влияние различных величин напряжения сдвига. Мы также описываем пути связывания RhoGDIα с Rho GTPases при миграции клеток. Результаты показывают, что активация RhoGDIα имеет регулирующий метод, относительно независимый от Rho GTPases, который активируется при сдвиговом напряжении и находится под влиянием текучести клеточной мембраны, микрофиламентов и Src.

Результаты

Биосенсор FRET на основе sl-RhoGDIα отражает активность RhoGDIα

RhoGDIα был разработан с учетом того факта, что молекула RhoGDIα может связываться с доменом переключателя II (рис. 1а). Был сконструирован вариант биосенсора R66E-sl-RhoGDIα, в котором 66 Arg переключателя II был мутирован в Glu, чтобы предотвратить его связывание с RhoGDIα, в качестве отрицательного контроля для ингибирования комбинации RhoGDIα и переключателя II (рис. 1b). S-RhoGDIα (без линкера) и nsl-RhoGDIα (без переключателя II и линкера) также были сконструированы в качестве контролей, чтобы продемонстрировать необходимость переключателя II и последовательности линкера в биосенсоре (рис.  1b). Белки биосенсоров очищали из BL21-компетентных клеток in vitro и использовали антитело RhoGDIα (1:1000, поликлональное антитело ARHGDIA, ABclonal) для обнаружения биосенсора RhoGDIα (23 кДа) и sl-RhoGDIα (79кДа) вестерн-блоттингом. Как показано на рис. 1с (дополнительный рисунок 1), четкие полосы можно было наблюдать при массе 23 кДа в продукте разрушения клеток, трансфицированных биосенсором или контрольной группой без трансфекции, в то время как при массе ~ 79 кДа также были видны четкие полосы. обнаружены в очищенном белке биосенсора sl-RhoGDIα, белке биосенсора R66E-sl-RhoGDIα и продукте разрушения клеток, трансфицированных биосенсором sl-RhoGDIα, но не в контрольной группе. Результаты показали его стабильную экспрессию как в эукариотических клетках, так и в кишечной палочке.

Рис. 1

Проверочные эксперименты биосенсора sl-RhoGDIα. a Схема биосенсора sl-RhoGDIα. b Структура sl-RhoGDIα и производных биосенсоров. Пунктирная линия означает, что эти части не существуют в структуре биосенсора. c Результаты вестерн-блоттинга при 23 и 79  кДа. Слева направо показаны очищенный белок R66E-sl-RhoGDIα, белок sl-RhoGDIα и продукт разрушения клеток контрольной группы без трансфекции и трансфицированных биосенсором sl-RhoGDIα. d Спектр излучения биосенсора sl-RhoGDIα до и после стимуляции антителом RhoGDIα. e Временной ряд эффективности FRET биосенсоров sl-RhoGDIα и R66E-sl-RhoGDIα при стимуляции антителом RhoGDIα. f Изображения живых клеток sl-RhoGDIα ( n  = 11), V-Rac и sl-RhoGDIα ( n  = 8), N-Rac и sl-RhoGDIα ( n  = 7) при сдвиге стресс. Направление напряжения сдвига снизу вверх, как показано стрелкой. Масштабная линейка 10 мкм

Изображение в натуральную величину

Для проверки работы биосенсора измеряли эмиссионные спектры флуоресценции очищенного белка sl-RhoGDIα в диапазоне 450–530 нм при возбуждении на длине волны 420 нм (SpectraMax M2, Molecular Devices). Более низкая эффективность передачи энергии наблюдалась после добавления специфического антитела RhoGDIα (разведение 1:25) для ингибирования связывания между RhoGDIα и переключателем II (рис. 1d). Кроме того, эффективность FRET (коэффициент эмиссии 475 нм/515 нм) очищенных белков sl-RhoGDIα и его биосенсора отрицательного контроля R66E-sl-RhoGDIα также измеряли при возбуждении при 420 нм в течение 20 мин. Увеличение наблюдалось при применении антитела RhoGDIα в sl-RhoGDIα, но не в R66E-sl-RhoGDIα (рис. 1e). Эти результаты показали пригодность конструкции биосенсора для связывания между RhoGDIα и переключателем II, а также показали специфичность биосенсора sl-RhoGDIα для обнаружения активации RhoGDIα.

Для дальнейшей проверки валидности, специфичности и обратимости биосенсора in vivo к клеткам, трансфицированным биосенсором, в качестве стимуляции применяли 20 дин см -2 напряжения сдвига. Очевидное снижение эффективности FRET, указывающее на отделение переключателя II от RhoGDIα при стимуляции, было обнаружено в sl-RhoGDIα, но не в R66E-sl-RhoGDIα (рис. 1f, дополнительные рисунки 2a и 2b). Интересно, что снижение прекратилось, когда напряжение сдвига было снято после приложения продолжительностью 5 минут, а затем эффективность FRET медленно увеличивалась со временем после снятия напряжения сдвига (дополнительные рисунки 2b и 2c). Очевидные различия между контрольной группой и обратным тестом начинали проявляться, когда напряжение сдвига снималось на 26 мин и сохранялось ( p 26min  = 0.034, p 27min  = 0.037, p 28min  = 0.042, p 29min  = 0.044, and p 30min  = 0.041, Supplementary Figure 2c) . Однако снижение эффективности FRET исчезало, когда клетка с sl-RhoGDIα была совместно трансфицирована плазмидой V-Rac или N-Rac, обе из которых обеспечивали экзогенный домен переключателя II, хотя они могут усиливать или ингибировать активность Rac, соответственно (фиг. 1е). Эти результаты подтвердили, что биосенсор sl-RhoGDIα может эффективно и специфически тестировать активацию RhoGDIα. Кроме того, 2 ммоль на л NaOH использовали для разрушения водородных связей между RhoGDIα и переключателем II внутри биосенсора, что вызывало заметное снижение эффективности FRET в биосенсоре sl-RhoGDIα, но не столь очевидное в s-RhoGDIα, nsl- RhoGDIα или R66E-sl RhoGDIα (дополнительный рисунок 2d). Результаты показали, что основной причиной переноса энергии было сочетание RhoGDIα с переключателем II водородными связями, и линкер между ними был необходим для повышения эффективности переноса энергии. Клетки с биосенсорами также обрабатывали ГТФ, так как ГТФ участвует в связывании RhoGDIα-Rho ГТФаз. Десять мкмоль на л GTP вызывает снижение эффективности FRET в sl-RhoGDIα и мягкое снижение в R66E-sl-RhoGDIα, в то время как в s-RhoGDIα или nsl-RhoGDIα эффект не обнаружен (дополнительная фигура 2e). Также было доказано, что переключатель II необходим для передачи энергии, а линкер повышает его эффективность.

Эти результаты означают, что биосенсор sl-RhoGDIα может эффективно обнаруживать изменение эффективности FRET, вызванное комбинацией RhoGDIα с переключателем II, посредством водородных связей как в клетках in vitro, так и в живых клетках. Более того, на эффективность переноса особенно влияло чередование активности RhoGDIα, а не Rho GTPases.

Сублокация и величина потока влияют на активность RhoGDIα

Поскольку Rho GTPases существует в двух различных состояниях, активированных на мембране и неактивированных в цитоплазме 18 , sl-RhoGDIα был разработан, чтобы показать сродство RhoGDIα-Rho ГТФаз в цитоплазме, в то время как Kras- и Lyn-sl-RhoGDIα указывали на присутствие комплекса на клеточной мембране, в нелипидных участках рафта. или на липидных рафтах. Изображения клеток, трансфицированных биосенсорами sl-RhoGDIα, Kras-sl-RhoGDIα и Lyn-sl-RhoGDIα соответственно, показали явные локальные различия в живых клетках, доказывая, что биосенсор sl-RhoGDIα существует в цитоплазме, а последовательность Kras/Lyn связана биосенсор к клеточной мембране, как и ожидалось. Напряжение сдвига применялось в течение 30 минут, чтобы биосенсоры имели достаточно времени для стабилизации. Напряжение сдвига 5 дин см -2 привел к снижению коэффициента FRET примерно на 25% в sl-RhoGDIα (дополнительный фильм 1, дополнительный рисунок 3a, дополнительная таблица 1) и Kras-sl-RhoGDIα (дополнительный фильм 2, дополнительный рисунок 3a, дополнительная таблица 2) . Таким образом, активность RhoGDIα в цитоплазме и областях нелипидного рафта на мембране снижалась аналогичным образом при приложении напряжения сдвига (дополнительная таблица 3, p Kras-Cyto  = 0,618).

Однако в Lyn-sl-RhoGDIα (дополнительный фильм 3) активность RhoGDIα оставалась относительно неизменной после применения потока и отличалась от активности sl-RhoGDIα и Kras-sl-RhoGDIα (рис. 2b, 9).0487 p Lyn-Cyto  = 0,012, p Lyn-Kras  = 0,007). Более того, различия между этими биосенсорами исчезли, когда величина напряжения сдвига возросла до 20 дин см -2 , что указывало на сходные ответы активности RhoGDIα, уменьшающиеся примерно на 20% в разных положениях (рис. 3b, дополнительный фильм 4–6, Дополнительный рисунок 3b, дополнительная таблица 3, p Lyn-Cyto  = 0,820, p Lyn-Kras  = 0,880, p Крас-Цито  = 0,745). При напряжении сдвига 40 дин см -2 диссоциация RhoGDIα и Rho GTPases в цитоплазме и липидных рафтах была меньше, чем в двух других режимах потока, но оставалась заметной в нелипидных рафтах (рис. 4b, дополнительная Фильм 7–9, дополнительная фигура 3d).

Рис. 2

Аффинность RhoGDIα и Rho GTPases в различных субклеточных локализациях при сдвиговом напряжении 5 дин см -2 . a Изображения живых клеток трех биосенсоров до 5 дин см −2 напряжения сдвига. Cyto представляет собой биосенсор sl-RhoGDIα ( n  = 6), который существует в цитоплазме. Kras представляет собой Kras-sl-RhoGDIα ( n  = 8), а Lyn представляет Lyn-sl-RhoGDIα ( n = 6). Стрелка показывает направление напряжения сдвига. Масштабная линейка составляет 10  мкм. b Влияние напряжения сдвига на степень связывания RhoGDIα и Rho. c Сравнение соотношения FRET/ECFP восходящего и нисходящего потока после нормализации. Звездочка означает, что существует очевидная разница между восходящим и нисходящим потоком. d Распределение степени связывания RhoGDIα и Rho. Процент отношения FRET каждой области в целом нормализуется перед приложением напряжения сдвига. Диссоциация комплекса RhoGDIα-Rho подавляется ниже по течению вдоль направления потока a Изображения живых клеток трех биосенсоров до 20 дин см −2 напряжения сдвига. Биосенсоры обозначены как на рис. 2, Cyto ( n  = 10), Kras ( n  = 9) и Lyn ( n  = 8). Стрелка показывает направление напряжения сдвига. Масштабная линейка составляет 10 мкм. b Степень связывания RhoGDIα и Rho в зависимости от напряжения сдвига. c Сравнение соотношения FRET/ECFP восходящего и нисходящего потока после нормализации. Звездочка означает, что существует очевидная разница между восходящим и нисходящим потоком. д Распределение степени связывания RhoGDIα и Rho. Процент отношения FRET каждой области в целом нормализуется перед приложением напряжения сдвига. Диссоциация комплекса RhoGDIα-Rho GTPases ингибируется ниже по течению вдоль направления потока a Изображения живых клеток трех биосенсоров до 40 дин см −2 напряжения сдвига. Биосенсоры помечены, как на рис. 2, Cyto ( n  = 11), Kras ( n  = 11) и Lyn ( n  = 11). Стрелка показывает направление напряжения сдвига. Масштабная линейка составляет 10  мкм. b Степень связывания RhoGDIα и Rho в зависимости от напряжения сдвига. c Сравнение соотношения FRET/ECFP восходящего и нисходящего потока после нормализации. Звездочка означает, что существует очевидная разница между восходящим и нисходящим потоком. д Распределение степени связывания RhoGDIα и Rho. Процент отношения FRET каждой области в целом нормализуется перед приложением напряжения сдвига. Диссоциация комплекса RhoGDIα-Rho ГТФаз ингибируется ниже по течению вдоль направления потока напряжение сдвига. С биосенсором Kras-sl-RhoGDIα, 5 дин см -2 напряжения сдвига вызвало очевидную разницу ( p  = 0,015) между мерами выше по течению (край, обращенный к потоку) и мерами ниже по течению (край, противоположный восходящему по направлению потока), с более высокой активностью RhoGDIα ниже по течению в нелипидных участках клеточной мембраны. Однако соответствующая активность в цитоплазме всей области, измеренная биосенсором sl-RhoGDIα, и в липидных рафтах, измеренная биосенсором Lyn-sl-RhoGDIα, не изменилась (рис. 2в, г). Кроме того, активность RhoGDIα показала поляризацию ( P CYTO = 0,004, P KRAS = 0,026, P LYN = 0,034) для всех трех биосенсоров под 20 DYN 1 2 9026). При 40 дин см -2 напряжения сдвига разница исчезла для sl-RhoGDIα и Lyn-sl-RhoGDIα ( p  = 0,001), но осталась для Крас-sl-RhoGDIα (рис. 4в, г). Эти результаты показали, что RhoGDIα-Rho GTPases имели сложные паттерны диссоциации при напряжении сдвига, на которые влияли величины потока, и что поляризация активности RhoGDIα была более очевидной на клеточной мембране, особенно на нелипидных участках рафта.

Текучесть мембраны влияет на активность RhoGDIα при ламинарном течении

Как показано выше, изменение активности RhoGDIα на клеточной мембране, вызванное сдвиговым напряжением, имеет более очевидную полярность, поэтому биосенсор Lyn-sl-RhoGDIα применяли в следующих экспериментах для тестирования Эффект текучести мембран. Поскольку текучесть мембраны была наиболее заметной характеристикой клеточной мембраны и неотделима от липидных рафтов, для повышения текучести мембраны использовали предварительную инкубацию с бензоловым спиртом (БС) при 45 ммоль на л в течение 15 мин 19 . Затем оценивали влияние текучести мембраны на активность RhoGDIα при напряжении сдвига 20 дин см -2 . Аффинная полярность стала сильнее по сравнению с контрольной группой ( p = 0,015, рис. 5b – d), в то время как общая активность по-прежнему снижалась аналогично контрольной группе (дополнительный фильм 10, дополнительный рисунок 4a, дополнительная таблица 4, p ). BA-Control  = 0,722). Когда клетки обрабатывали холестерином (CHO) в количестве 0,1 ммоль на л в течение 3 часов для снижения текучести мембран, активность RhoGDIα снижалась примерно на 30% при применении ламинарного потока, что было более значительным, чем в контроле (дополнительная фигура 4a и Дополнительный фильм 11). Хотя полярность все еще существовала после предварительной обработки CHO, при сравнении этой обработки с контрольной группой не было обнаружено очевидной разницы (рис. 5b–d, дополнительная таблица 4, 9).0487 p CHO-Control  = 0,007). Таким образом, повышение текучести мембран усугубляет поляризацию активности RhoGDIα, индуцированной напряжением сдвига, в то время как ингибирование текучести мембран влияет только на активность.

Рис. 5

На сродство RhoGDIα и Rho GTPases при сдвиговом напряжении влияет текучесть мембраны. a Изображения живых клеток биосенсора Lyn-sl-RhoGDIα при сдвиговом напряжении 20 дин см -2 с 45  ммоль на л бензолового спирта (BA, n  = 8) или 0,1 ммоль на л холестерина (CHO, n  = 10). Масштабная линейка составляет 10  мкм. b Сравнение отношения FRET/ECFP восходящего и нисходящего потоков после нормализации. c Соотношение среднего восходящего/нисходящего потока для контрольной группы и группы BA/CHO. Звездочка означает, что существует очевидная разница между восходящим и нисходящим потоком. d Распределение степени связывания RhoGDIα и Rho ГТФаз при изменении текучести мембраны. Процент отношения FRET каждой области в целом нормализуется перед приложением напряжения сдвига. Диссоциация комплекса RhoGDIα-Rho GTPases ингибируется ниже по течению в направлении потока, когда текучесть мембраны увеличивается за счет BA. Звездочка означает очевидную разницу по сравнению с контрольной группой 9.0003

Изображение полного размера

Цитоскелет участвует в полярности RhoGDIα при сдвиговом напряжении

Поскольку цитоскелет тесно связан с клеточной мембраной, казалось, что цитоскелет будет влиять на комплекс RhoGDIα-Rho GTPases. Чтобы проверить это, клетки предварительно обрабатывали различными лекарственными средствами для деполимеризации различных компонентов цитоскелета до того, как применялось напряжение сдвига 20 дин см -2 . ML-7 был ингибитором киназы легкой цепи миозина (MLCK), который мог устранять передачу силы только через микрофиламенты, в то время как структура оставалась интактной 19,20 . Когда микрофиламенты обрабатывали 5 мкмоль на л ML-7 в течение 1 ч перед приложением ламинарного напряжения сдвига, наблюдалось более очевидное снижение активности RhoGDIα, почти на 38%, при напряжении сдвига (дополнительный фильм 12, дополнительный рисунок 4b, дополнительная таблица 4, p ML7-Control  = 0,005). Распределение локальной активности было более поляризованным ( p  = 0,007) по сравнению с контрольной группой (рис. 6). Предварительная инкубация цитохалазина D (CytoD) в концентрации 2 мкмоль на л в течение 1 ч для разрушения микрофиламента вызывала аналогичный эффект на комплекс RhoGDIα-Rho GTPases после 30 мин приложения ламинарного напряжения сдвига. Диссоциация комплекса снизилась до 35%, а полярность увеличилась по сравнению с контрольной группой ( р  = 0,032; Рис. 6 и дополнительный рисунок 4b и дополнительный фильм 13). Это указывало на то, что микрофиламенты участвовали в активации RhoGDIα, вызванной напряжением сдвига. Однако по сравнению с контрольной группой не наблюдалось значительного изменения активности RhoGDIα после применения 1 мкмоль на л нокодазола (NOCO), деполимеризующего агента микротрубочек, за 1 ч до приложения ламинарного напряжения сдвига. Однако активность RhoGDIα имела поляризованное распределение, более заметное, чем у контрольной группы, при разрушении микротрубочек (9). 0487 р  = 0,025; Рис. 6d и дополнительный фильм 14). Таким образом, цитоскелет участвовал в диссоциации комплекса RhoGDIα-Rho ГТФаз при сдвиговом напряжении, а микрофиламенты играли более важную роль, чем микротрубочки.

Рис. 6

Сродство RhoGDIα и Rho GTPases при сдвиговом напряжении зависит от цитоскелета. a Изображения живых клеток биосенсора Lyn-sl-RhoGDIα при сдвиговом напряжении 20 дин см -2 , обработанных 5 мкмоль/л ML-7( n  = 5), 2 мкмоль на л цитохалазина D (CytoD, n  = 9) или 1 мкмоль на л нокодазола (NOCO, n  = 7). Масштабная линейка составляет 10  мкм. b Сравнение отношения FRET/ECFP восходящего и нисходящего потока после нормализации. c Усредненное соотношение вверх/вниз по течению в контрольной группе и в группах BA/CHO. Звездочка означает, что существует очевидная разница между восходящим и нисходящим потоком. d Распределение степени связывания RhoGDIα и Rho GTPases усиливается вниз по течению вдоль направления потока, когда цитоскелет нарушен. Процент отношения FRET каждой области в целом нормализуется перед приложением напряжения сдвига. Звездочка означает очевидную разницу по сравнению с контрольной группой 9.0003

Изображение полного размера

Полярность RhoGDIα, индуцированная сдвиговым напряжением, связана с Src

Поскольку Src может фосфорилировать RhoGDIα, чтобы ингибировать RhoGDIα и Rho GTPases от образования комплексов 21 , эффект Src был протестирован путем предварительной обработки клеток 50 ммоль на л ингибитора Src PP1 за 30 мин 19 . Результат ясно показал, что активность RhoGDIα резко снижалась ниже по течению при приложении напряжения сдвига (рис. 7d, дополнительная таблица 4, p 9).0293 pp1-Control  = 0,006), и общая активность повысилась после применения ламинарного потока по сравнению с контрольной группой (дополнительный фильм 15, дополнительный рисунок 4c).

Рис. 7

На сродство RhoGDIα и Rho GTPases при сдвиговом напряжении влияет Src. a Изображения живых клеток биосенсора Lyn-sl-RhoGDIα при 20 дин см -2 напряжения сдвига с 50  ммоль на л ингибитора Src PP1 ( n  = 7). Масштабная линейка составляет 10  мкм. b Сравнение отношения FRET/ECFP восходящего и нисходящего потоков после нормализации. c Среднее соотношение входящего/выходящего потока для контрольной группы и группы PP1. Звездочка означает, что существует очевидная разница между восходящим и нисходящим потоком. d Распределение степени связывания RhoGDIα и Rho GTPases усиливается в восходящих областях вдоль направления потока, когда Src ингибируется. Процент отношения FRET для каждой области в целом нормализуется до приложения напряжения сдвига. Звездочка означает очевидную разницу по сравнению с контрольной группой 9.0003

Изображение с полным размером

Активация RhoGDIα отличается на участках нелипидного рафта

Как показали результаты, активность и полярность RhoGDIα при сдвиговом напряжении были связаны с текучестью мембраны, цитоскелетом и Src, в то время как биосенсор на основе Kras иначе. Ингибирование активности Src может поддерживать диссоциацию комплекса RhoGDIα и Rho GTPases в нелипидных областях рафта при сдвиговом напряжении (дополнительный фильм 21, дополнительные рисунки 5a и 5d, n pp1  = 5), что согласуется с результатом биосенсора на основе Lyn. Однако при такой же предварительной обработке текучести мембраны и цитоскелета общая активность RhoGDIα не показала очевидных различий по сравнению с контрольной группой (дополнительные рисунки 5a, 5b и 5c, дополнительный фильм 17–20).

Что касается аффинного распределения RhoGDIα и Rho GTPases в нелипидных областях плота, ингибирование активности Src вызывало обмен полярностью между восходящим и нисходящим потоком (дополнительная фигура 6), а увеличение текучести мембраны способствовало изменению полярности после приложения напряжения сдвига ( p  = 0,007, дополнительная фигура 7), которые соответствовали полярному распределению на липидных рафтах. Однако изменения в статусе микрофиламентов, вызванные ML-7 и CytoD, не повлияли на полярность RhoGDIα, в то время как разрушение микротрубочек с помощью NOCO улучшило полярность (дополнительная фигура 8).

Обсуждение

Предыдущие исследования RhoGDIα в основном были сосредоточены на регуляции Rho GTPases. Меньше внимания уделялось тому, как RhoGDIα активируется в физиологических процессах. Вероятной причиной этого пробела в этой области было отсутствие адекватного инструмента для обнаружения несвязанного RhoGDIα в живых клетках без вмешательства Rho GTPases. Ву и др. сообщили о биосенсоре RhoGDIα-YFP, который был совместно трансфицирован CFP-ROP2 и CFP-ROP6 для формирования передачи энергии в живых клетках, что могло бы уловить взаимодействие между RhoGDIα и ROPs 22 . Констадинос предоставил еще один анализ для визуализации контроля нацеливания на мембрану Rac1. Два разных GFP-меченых Rac, коэкспрессированных с RhoGDIα и без RhoGDIα, трансфицировали с помощью MCherry в клетки. Когда Rac, меченный GFP, передавался на клеточную мембрану, соотношение FRET между MCherry и GFP менялось. Сравнивая разницу в соотношении между RhoGDIα-Rac, меченным GFP, и Rac, меченным GFP, этот анализ может показать способность RhoGDIα ингибировать направленную на мембрану транслокацию Rac 9. 0261 23 . Ходжсон присоединил пару флуоресцентных белков к N-концу Cdc42 с помощью связывающей антенны. Соотношение FRET между двумя флуоресцентными белками сильно зависит только от взаимодействия с RhoGDIα, которое может демонстрировать пространственно-временную динамику взаимодействия RhoGDIα-Cdc42 24 . Однако эти биосенсоры могли показать взаимодействие RhoGDIα только с одной мембраной семейства Rho, на которую влияет активация Rho GTPases. Следовательно, изменение самой RhoGDIα без влияния Rho-ГТФаз проверить не удалось из-за конформационных изменений Rho-ГТФаз, вызванных ее активацией.

На основе технологии FRET в рамках этого проекта разработан новый биосенсор для наблюдения за связыванием RhoGDIα и Rho GTPases, что указывает на активность RhoGDIα. Эффективность переноса энергии связана с расстоянием между парами флуоресцентных белков, которое регулируется за счет объединения RhoGDIα с переключателем II посредством водородных связей. Разрушение водородных связей щелочным или мутирующим переключателем II снижает эффективность, что подтверждает конформационные изменения, вызванные комбинацией внутри биосенсора, а также доказывает эффективность принципа биосенсора sl-RhoGDIα.

Центральной структурой биосенсора sl-RhoGDIα является переключатель II, последовательность, общая для Rho GTPases, которая может соединяться с RhoGDIα посредством водородных связей. Домен переключателя II в биосенсоре предотвращает потенциальные эффекты гиперэкспрессии RhoGDIα на эндогенные Rho GTPases. В живых клетках эффективность FRET биосенсора sl-RhoGDIα снижается после приложения напряжения сдвига и немного восстанавливается после снятия напряжения сдвига. Эта тенденция к медленному увеличению после снятия напряжения сдвига означает, что эффективность FRET в ответ на стимул является обратимой. Кроме того, изменение эффективности переноса энергии при пространственной реконструкции должно осуществляться только за счет активации RhoGDIα, а не переключения II в силу его стабильных характеристик 11 . Это подтверждается совместной трансфекцией sl-RhoGDIα с N-Rac или V-Rac. Хотя определенные сайты мутированы в N-Rac или V-Rac для ингибирования или усиления активности Rac соответственно 25,26 , такое же ингибирование эффективности FRET, вызванной напряжением сдвига, наблюдается в биосенсоре, поскольку как N-Rac, так и V- Rac может связываться с RhoGDIα внутри биосенсора sl-RhoGDIα в живых клетках. Эксперимент с антителом RhoGDIα in vitro показывает сходное свидетельство специфичности. Антитело может специфически связываться с RhoGDIα в биосенсоре и блокировать его сайты связывания переключателя II. Кроме того, биосенсор показывает свою обратимость в живых клетках и префект стабильности как в пробирке, так и в живых клетках, таким образом предоставляя визуальный инструмент для изучения механизма регуляции RhoGDIα в его ассоциации с Rho GTPases. Однако следует отметить, что биосенсор sl-RhoGDIα указывает на чередование пространственно-временной активности RhoGDIα в ответ на стимул, а не на реальную степень связывания между RhoGDIα и Rho ГТФазами в живых клетках.

Текущее исследование показывает, что RhoGDIα отделяется от переключателя II, когда к клетке применяется ламинарный поток, что означает, что комплекс RhoGDIα-Rho GTPases диссоциирует, и ингибирование RhoGDIα на Rho GTPases уменьшается при напряжении сдвига. Это явление согласуется с тем фактом, что Rho GTPases активируются напряжением сдвига 27 . Кроме того, эта диссоциация неравномерна вдоль направления ламинарного течения. Это открытие похоже на особенность индуцированной сдвиговым напряжением активации Rho GTPases, которая обычно демонстрирует сильный пространственный паттерн. Было подтверждено, что активность члена семейства RhoA достигает пика на переднем крае, за которым следуют Cdc42 и Rac 9.0261 28 . При приложении напряжения сдвига Rac1 активируется на переднем крае клеток вдоль направления потока 29,30,31 , а активированный Cdc42 также поляризуется в областях ниже по течению 32 . Интересно, что активация RhoGDIα снижается медленнее в аналогичных позициях в текущей работе, что указывает на то, что негативная регуляция происходит в процессе RhoGDIα, регулирующего Rho GTPases при напряжении сдвига. Активированные Rho GTPases собираются в нижележащих областях вдоль направления напряжения сдвига, в то время как связывание комплекса RhoGDIα-Rho GTPase в той же области выше, чем в других областях. Парадоксально, но подобное явление наблюдалось и в другой работе. RhoGDIα, активированный фосфорилированием Src, проявляет более низкое сродство с Rho-GDP и перемещается к переднему краю клеток, где происходит сборка GTP-связывания-Rho 33 , что, по-видимому, показывает, что RhoGDIα пытается регулировать активацию Rho до нормального уровня. Однако детали механизма до сих пор неясны.

Активность RhoGDIα тесно связана с субклеточным расположением и величиной силы. Экспрессия активированного Rac1 увеличивается при низком напряжении сдвига (5 дин см -2 ) по сравнению с нормальным напряжением сдвига (20 дин см -2 ) 34 . В качестве отрицательного регулятора комплексная диссоциация в цитоплазме испытывает большее напряжение сдвига при низком напряжении сдвига, чем при нормальном напряжении или напряжении с высоким сдвигом. Результаты согласуются с предыдущими отчетами, предполагающими, что низкое напряжение сдвига будет уменьшать диссоциацию комплекса RhoGDIα-Rho GTPases и высвобождать больше Rho GTPases, трансформированных для связывания GTP 9. 0261 34 . Однако активность RhoGDIα на мембране, по-видимому, претерпевает эксцентрические изменения. Активность RhoGDIα в нелипидных участках плота нечувствительна к величине силы. Вероятно, это связано с тем, что после диссоциации Rac1 или родственных Rho GTPases из RhoGDIα они будут подвергаться влиянию некоторых GTPase-активирующих белков (GAPs) и затем перейдут в неактивированный статус, если они переместятся в нелипидные области рафтов -23- . Это означает, что ключом к сохранению неактивированного Rho GTPases в нелипидных участках рафта должны быть GAP, а не RhoGDIα, и, следовательно, активность, проявляемая биосенсором, остается постоянной при различных уровнях напряжения сдвига. Однако активность RhoGDIα на липидных рафтах снижается в большей степени при нормальных условиях, чем при высоком или низком напряжении сдвига. Различие может быть связано со структурой липидных рафтов и цитоскелета. Липидные рафты представляют собой мембранные домены, обогащенные холестерином и некоторыми насыщенными ациллипидами 9. 0261 35,36 . Эти домены динамичны и закреплены актиновыми филаментами. Это закрепление липидных рафтов с актиновыми филаментами позволяет липидным рафтам двигаться в ограниченном диапазоне 37 , и различия, наблюдаемые среди величин сил, могут отражать кинетические особенности липидных рафтов или актиновых филаментов. Актиновые филаменты являются основной внутриклеточной силой тяги. Волокна актинового напряжения постепенно исчезают в ответ на промежуточное напряжение сдвига, но увеличиваются при низком или высоком напряжении сдвига 38,39 . Существует тесная связь между актиновыми стрессовыми волокнами и Src, важным регулятором активности RhoGDIα, который помогает актиновым стрессовым волокнам опосредовать RhoGDIα. В наших результатах активность RhoGDIα в отношении липидных рафтов повышается, когда актиновые филаменты увеличиваются при низком или высоком сдвиговом напряжении (дополнительная фигура 4f), в то время как разрушение микрофиламентов лекарствами усугубляет диссоциацию комплекса RhoGDIα-Rho GTPases (дополнительная фигура 4b). Возможно, что диссоциация комплекса RhoGDIα-Rho GTPases регулируется напряжением сдвига в зависимости от его величины, что вызывает реорганизацию актиновых филаментов, а затем влияет на полярность Src. Феномен наиболее заметен в областях липидных рафтов, вероятно, потому, что актиновые филаменты напрямую связаны с липидными рафтами.

Клеточная мембрана изолирует клетку от внешней среды и передает силу поляризованным образом при механической нагрузке 40 . Цитоскелет может ощущать и передавать механическую силу на специфические участки клетки, т.к. многие участки мембраны могут быть связаны с актиновыми микрофиламентами -41-. Напряжение сдвига может сначала восприниматься мембраной, а затем передаваться на актиновый цитоскелет непосредственно за счет деформации мембраны, а затем передаваться через актиновый цитоскелет для активации последующих сигнальных путей 42,43 . Действительно, наши результаты показывают, что текучесть мембраны и цитоскелет влияют на образование и диссоциацию комплекса RhoGDIα-Rho GTPase, индуцированного сдвиговым напряжением. Это посредничество более очевидно для липидных рафтов, в то время как для комплекса в нелипидных областях рафтов только на полярность комбинации влияет статус текучести мембраны или цитоскелета. Общая активность RhoGDIα в нелипидных участках рафта не имеет отчетливого ответа, когда нарушается текучесть мембраны или цитоскелет. Вместе с результатами, согласно которым активность RhoGDIα в области нелипидного рафта не имеет четкой связи с величинами напряжения сдвига, упомянутыми выше, кажется, что RhoGDIα, опосредованный напряжением сдвига, в основном находится на липидных рафтах, а не в нелипидных областях рафта. Интересно, что стимулирование текучести мембраны само по себе может изменить распределение аффинности комплекса RhoGDIα-Rho GTPases как на участках нелипидных рафтов, так и на липидных рафтах, в то время как ингибирование текучести мембран не имеет эффектов. Это может быть связано с тем, что ингибирование текучести мембран приводит к тому, что положения липидных рафтов становятся более фиксированными и, таким образом, затрудняется формирование полярности. Однако в наших результатах представляется, что активность RhoGDIα не изменяется за счет текучести мембраны или цитоскелета непосредственно при напряжении сдвига.

Src локализуется на эндосомальных мембранах как тип нерецепторной киназы. Напряжение сдвига может вызвать поляризованную активацию Src в эндотелиальных клетках на краю, обращенном к потоку 19 . ß 3 интегрины прикрепляются к актиновым стрессовым волокнам и функционируют как механосенсоры 44 . Его цитоплазматический хвост рекрутирует Src и Shp-1/2 для образования сигнального комплекса, а затем PKG II трансформируется в комплекс ß 3 -Shp-Src для дефосфорилирования Shp-1; Активация Shp-1 приводит к фосфорилированию Src до активного Src неравномерным образом; 19,45 Src-опосредованное фосфорилирование RhoGDIα предотвращает взаимодействие и повторное связывание ассоциированных с мембраной Rho GTPases с RhoGDIα 21 . Поляризующая активность Src обеспечивает пространственное руководство и регулирует диссоциацию RhoGDIα и Rho GTPases посредством фосфорилирования первых или поддерживает комплекс в исходном состоянии. В клетках HeLa, используемых для этого исследования, когда Src специфически ингибируется PP1 19,46 , распределение RhoGDIα-Rho GTPases все еще генерирует перенос поляризации. Вероятно, это связано с тем, что полярность Src устраняется или ослабляется с помощью PP1 в вышестоящей области, и затем Src-опосредованное фосфорилирование RhoGDIα соответственно снижается в этих областях. Кроме того, способность RhoGDIα образовывать комплекс с Rho GTPases резко усиливается в этом месте. Дополнительным доказательством является то, что активация поляризованного Src зависит от актиновых филаментов и текучести мембран при ламинарном течении. Разрушение актиновых филаментов может усиливать поляризованную активацию Src, вызывая диссоциацию большего количества Rho GTPases от RhoGDIα. Опосредованное бензиловым спиртом усиление текучести мембран может ингибировать вызванную напряжением сдвига полярность Src 19 . Аналогичный вывод сделан на основании того, что комплекс RhoGDIα-Rho GTPases разделяется более явно, когда текучесть мембраны ингибируется. Следовательно, диссоциация RhoGDIα и Rho, вызванная напряжением сдвига, может быть связана с изменениями активации Src, которые происходят при напряжении сдвига.

Как регуляторный фактор Rho GTPases, большинство исследований показали, что комбинация RhoGDIα и Rho основана на активации Rho GTPases. Тем не менее, некоторые вышестоящие молекулы нацеливаются на RhoGDIα напрямую, чтобы изменить его конформацию, модифицировать его и изменить его местоположение, чтобы воздействовать на нижестоящие сигнальные пути 47 . Эти микрофиламенты играют разные роли в связывании RhoGDIα и Rho GTPases, опосредованном напряжением сдвига на липидных рафтах и ​​нелипидных рафтах, что было неожиданным результатом. При стимуляции факторов роста Src транспортируется к липидным рафтам из перинуклеарных областей и активируется актинзависимым образом, но активируется без передачи в нелипидных рафтах с помощью микротрубочек 48 , что указывает на то, что активация Src зависит от субклеточное расположение. Это может быть причиной того, что микрофиламенты могут влиять на полярность RhoGDIα на липидных рафтах, а микротрубочки влияют на полярность нелипидных рафтов. В предыдущем исследовании Rac1 активировался напряжением сдвига непосредственно силой, передаваемой вниз по течению с помощью клеточной мембраны и микротрубочек, но это не имеет отношения к Src 9.0261 49 . Кроме того, активация Src медленнее, чем Rac1 49 , при приложении напряжения сдвига, что означает, что Src-опосредованная активация RhoGDIα будет намного медленнее, чем Rac1. Основываясь на этих результатах, активация Rac1, вызванная сдвиговым напряжением, не должна иметь прямой связи с активацией RhoGDIα. Кроме того, также было обнаружено, что клеточная мембрана ощущала характер течения и деформировалась, чтобы передать силу активным Rho GTPases на липидных рафтах под напряжением сдвига через микротрубочки 27,50 , тогда как активный RhoGDIα рекрутировался через актин с помощью Src. Различные компоненты цитоскелета опосредуют активацию Rho GTPases и RhoGDIα при приложении напряжения сдвига. Следовательно, можно предположить, что активация RhoGDIα, индуцированная сдвиговым напряжением, происходит иначе, чем Rho GTPases, хотя RhoGDIα является негативным регулятором Rho GTPases.

В этой статье предлагается биосенсор FRET, который может измерять степень связывания RhoGDIα и Rho в живых клетках, обеспечивая полезный визуальный инструмент для наблюдения за активацией RhoGDIα в режиме реального времени без вмешательства Rho GTPases. На основе результатов биосенсора построена модель регуляции комплекса RhoGDIα-Rho GTPases и того, как RhoGDIα выполняет свою функцию при сдвиговом напряжении. Модель можно упростить следующим образом (рис. 8): плазматическая мембрана деформируется при приложении внеклеточного напряжения сдвига для неоднородного повышения текучести клеточной мембраны, а затем переводит напряжение во внутриклеточные силы, которые по актиновым филаментам передаются в концентрацию напряжения точки на дистальном конце через их сокращения. Некоторые механосенсоры, такие как ß 3 интегрины, прикрепленные к актиновым стрессовым волокнам 44 раскачивают свои хвосты и локально фосфорилируют Src через комплекс ß 3 -Shp-Src; 19,45 поляризующая активность Src обеспечивает пространственное руководство и регулирует диссоциацию RhoGDIα и Rho GTPases посредством фосфорилирования первой или поддерживает комплекс в исходном состоянии. Этот путь относительно независим и не имеет прямой связи с индуцированной сдвиговым напряжением активацией Rho GTPase.

Рис. 8

Предлагаемый механизм активации RhoGDIα, индуцированной напряжением сдвига полная последовательность RhoGDIα, последовательность переключателя II, последовательность линкера и пары флуоресцентных белков ECFP/Ypet для FRET 51 (рис. 1b). Switch II является общим доменом, общим для Rho GTPases, и может образовывать контакты с RhoGDIα, которые, по-видимому, не вызывают значительных изменений в его собственной конформации 11 . В конструкции биосенсора изменения расстояния между переключателем II и RhoGDIα представляют изменения аффинности RhoGDIα и Rho GTPases, которые должны быть вызваны только изменением активности RhoGDIα 11 . Линкерная последовательность (GGSGGT) была разработана между доменом RhoGDIα и переключателем II, чтобы обеспечить сайт для изгиба для повышения эффективности FRET. Чтобы продемонстрировать необходимость переключателя II и последовательности линкера, контрастные биосенсоры только с последовательностью переключателя II и без последовательности переключателя II или линкера также были разработаны как s-RhoGDIα и nsl-RhoGDIα соответственно (рис. 1b). Поскольку комбинация переключателя II и RhoGDIα зависит от водородных связей между 185 Asp, 30 Ala и 31 Pro в RhoGDIα и 66 Arg в переключателе II, 66 Arg в домене переключателя II sl-RhoGDIα был мутирован в Glu, чтобы разрушить водородные связи между RhoGDIα и переключателем II 11 для создания биосенсора отрицательного контроля, R66E-sl-RhoGDIα.

Используя базовую структуру sl-RhoGDIα, последовательность Kras была вставлена ​​после Ypet, чтобы связать весь биосенсор с нелипидными областями рафтов на плазматической мембране 52 для создания Kras-sl-RhoGDIα (рис. 1b) . Последовательность Lyn была добавлена ​​позади ECFP, чтобы связать биосенсор с липидными рафтами 52 , что дало Lyn-sl-RhoGDIα (рис. 1b). Эти два мембранных биосенсора отражают степень связывания RhoGDIα и Rho GTPases соответственно в разных положениях мембраны.

Все упомянутые выше биосенсоры были сконструированы в плазмиды pcDNA3.1(+) для экспрессии в клетках HeLa, а биосенсорные последовательности sl-RhoGDIα и R66E-sl-RhoGDIα также были вставлены в плазмиду BL21 для получения и очистки белков для спектрального анализа и вестерн-блоттинг in vitro.

Культура клеток и транзиторная трансфекция

Перед трансфекцией клетки HeLa культивировали в модифицированной по Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 2  ммоль на л L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мг/л. мл пирувата натрия (GIBCO BRL). Липофектамин 3000 был выбран в качестве трансфекционного реагента для трансфекции различных плазмид ДНК в клетки. Клетки переносили на покрытые фибронектином покровные стекла после трансфекции в течение 24 часов и культивировали с 0,5% FBS в течение 12 часов перед применением ламинарного потока.

Проточные системы

Ламинарные потоки обеспечивались классической проточной камерой с параллельными пластинами, модифицированной для динамических наблюдений под микроскопом FRET 19 . Отделенные клетки HeLa высевали на предметное стекло, закрытое силиконовой прокладкой и покровным стеклом. Ламинарное напряжение сдвига было установлено равным 5, 20 и 40 дин см -2 соответственно путем регулирования потока жидкости в камере 53 . Эксперименты с потоком проводились при 37 °C с 5% CO 2 , чтобы поддерживать рН на уровне 7,4.

Получение изображений под микроскопом

Установка для получения изображений под микроскопом включала инвертированный микроскоп (Nikon Eclipse Ti Series, Ti-Fl Epi-fl/1) и холодную ПЗС-матрицу (Evolve TM 512, Photometrics). Все флуоресцентные изображения были получены на изолированной одиночной клетке с помощью программного обеспечения MetaFluor (Universal Imaging) один раз в каждые 60 с и расположены в хронологическом порядке, начиная с 001. Изображения различных каналов были созданы с помощью программного обеспечения MetaMorph (Universal Imaging) для изображений отношения FRET. Длины волн возбуждения и излучения ECFP составляют 420 и 475 нм соответственно, а длина волны излучения Ypet составляет 535 нм.

Анализ изображений

Программный пакет с использованием Matlab (Mathworks; Натик, Массачусетс) был разработан для быстрого анализа пространственно-временных данных флуоресценции, который содержит три различных раздела для предварительной обработки и анализа полярности. Во-первых, все флуоресцентные изображения считываются с двух каналов одного образца, включая параметры, указывающие направление напряжения сдвига и моменты времени, когда применялся ламинарный поток. Интенсивность флуоресценции в четырех углах изображения усреднялась для установки фона, который необходимо вычесть перед количественной оценкой и анализом изображения. После фильтрации спеклов и распознавания краев изображения соотношения, показывающие эффективность FRET, получаются путем вычисления конкретного значения FRET/ECFP. Среднее соотношение изменения целой клетки со временем показано линейной диаграммой для анализа того, как напряжение сдвига влияет на сродство RhoGDIα и переключателя II. Во-вторых, анализ полярности выполняется с использованием изображений соотношений. Одиночные клетки на изображениях отношений разделены в среднем на 50 частей одинаковой ширины по направлению ламинарного течения. Первая часть была пронумерована как 1 для представления нисходящего потока, а последняя — как 50 для представления восходящего потока. Процент интенсивности флуоресценции в каждой части от всей клетки рассчитывается для представления уровня связывания локальных RhoGDIα-Rho GTPases (дополнительная фигура 9). В-третьих, данные объединяются с непрерывными временными точками, а пространственные и временные изменения RhoGDIα нормализуются и отображаются на трехмерном графике.

Статистический анализ

Все данные соотношения были нормализованы по их базовым уровням перед стимуляцией в той же клетке. Статистический анализ проводили с использованием функции двустороннего t-теста, содержащейся в программном обеспечении Excel (Microsoft), для оценки статистической разницы между группами. Значительную разницу определили p -значение (<0,05). Чтобы уменьшить дискретность, вызванную выбором одной области, были выбраны первые пять областей и усреднены в каждый момент времени, чтобы представить ниже по течению от ячейки, а последние пять областей представляли вверх по течению. Когда существовала статистически значимая разница (по сравнению с двусторонним тестом t ) между значениями выше и ниже по течению через 30 минут с использованием двустороннего теста t , это указывало на наличие полярности. Все средства, задействованные в рукописи, изменены стандартным отклонением.

Доступность кода

Исходный код MATLAB для обработки изображений предоставляется в качестве дополнительного программного обеспечения 1. опухолевые клетки. Дж. Биомех. англ.   139 , 0210051–0210059 (2016).

Артикул Google ученый

  • Мазель, Т. Взаимные помехи сигнальных путей клеточной полярности. Протоплазма. 254 , 1241–1258 (2017).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Нараянан А. С., Рейес С. Б., Ум К., Маккарти Дж. Х. и Толиас К. Ф. Rac-GAP Bcr представляет собой новый регулятор комплекса Par, который контролирует клеточную полярность. Мол. биол. Cell 24 , 3857–3868 (2013).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Moissoglu, K. & Schwartz, MA. Пространственный и временной контроль функций Rho GTPase. Сотовый. Логист. 4 , e943618 (2014).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Цима, Е. Роль малых ГТФаз в динамике эндотелиального цитоскелета и реакции на сдвиговое напряжение. Обр. Рез. 98 , 176–185 (2006).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Boulter, E. & Garcia-Mata, R. RhoGDI: реостат для переключателя Rho. Малые ГТФазы 1 , 65–68 (2010).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Дезидерио, В. и др. Повышенное фукозилирование играет ключевую роль в инвазивных и метастатических свойствах стволовых клеток рака головы и шеи. Oncotarget 6 , 71–84 (2015).

    Артикул пабмед Google ученый

  • Джанг, Хо. Т. Т. и др. RhoGDI-альфа-зависимый баланс между RhoA и RhoC является ключевым регулятором онкогенеза раковых клеток. Мол. биол. Cell 22 , 3263–3275 (2011).

    Артикул Google ученый

  • Zhang, J., Li, T., Ji, W., Yu, Y. & Tan, T. Rho GDIalpha модулирует выживаемость и миграцию стволовых клеток трофобласта кролика. биол. Воспр. 93 , 144 (2015).

    ПабМед Google ученый

  • Hoffman, G. R., Nassar, N. & Cerione, R. A. Структура GTP-связывающего белка семейства Rho Cdc42 в комплексе с многофункциональным регулятором RhoGDI. Cell 100 , 345–356 (2000).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Wang, H. et al. Сверхэкспрессия RhoGDI, нового предиктора отдаленных метастазов, способствует пролиферации и миграции клеток при гепатоцеллюлярной карциноме. ФЭБС Письмо. 588 , 503–508 (2014).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Chiappetta, C. et al. Корреляция пути Rac1/RhoA с экспрессией эзрина при остеосаркоме. Заяв. Иммуногистохим. Мол. Морфол. 22 , 162–170 (2014).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Li, X. & Lee, A.Y. Семафорин 5A и плексин-B3 ингибируют подвижность клеток глиомы человека посредством RhoGDI-альфа-опосредованной инактивации Rac1 GTPase. J. Biol. хим. 285 , 32436–32445 (2010).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Абрамович Х. и др. Diacilglycerol kinase zeta регулирует реорганизацию актинового цитоскелета посредством диссоциации Rac1 от RhoGDI. Мол. биол. Cell 20 , 2049–2059 (2009).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ткаченко Е. и др. Протеинкиназа А управляет водителем ритма выпячивания-ретракции RhoA-RhoGDI в мигрирующих клетках. Нац. Клеточная биол. 13 , 660–667 (2011).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Гарсия-Мата, Р., Боултер, Э. и Берридж, К. «Невидимая рука»: регуляция RHO GTPases с помощью RHOGDI. Нац. Преподобный Мол. Клеточная биол. 12 , 493–504 (2011).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лю, Б. и др. RhoA и текучесть мембраны опосредуют пространственно поляризованную активацию Src/FAK в ответ на напряжение сдвига. науч. 4 , 7008 (2014).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Лю Б., Лу С., Чжэн С., Цзян З. и Ван Ю. Две отдельные фазы передачи сигналов кальция в потоке. Сердечно-сосудистые заболевания. Рез. 91 , 124–133 (2011).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • DerMardirossian, C., Rocklin, G., Seo, J.Y. & Bokoch, G.M. Фосфорилирование RhoGDI с помощью Src регулирует связывание Rho GTPase и цитозоль-мембранный цикл. Мол. биол. Cell 17 , 4760–4768 (2006).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ву, Ю. и др. CPK3-фосфорилированный RhoGDI1 необходим для развития проростков Arabidopsis и клеток эпидермиса листьев. Дж. Экспл. Бот. 64 , 3327–3338 (2013).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Moissoglu, K. et al. Регуляция транслокации и активации Rac1 мембранными доменами и их границами. J. Cell Sci. 127 , 2565–2576 (2014).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Ходжсон, Л. и др. Связывающая антенна FRET сообщает о пространственно-временной динамике взаимодействий GDI-Cdc42 GTPase. Нац. хим. биол. 12 , 802–809 (2016).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Salgado, A.P. et al. Изучение репликации вирусов осповакцины и коровьей оспы в доминантно-негативных клетках Rac1-N17. Мем. сделать Инст. Освальдо Круз 108 , 554–562 (2013).

    КАС Статья Google ученый

  • Jefferies, C.A. & O’Neill, L.A. Rac1 регулирует индуцированную интерлейкином 1 активацию ядерного фактора kappaB независимым от ингибирующего белка kappaBalpha способом, повышая способность субъединицы p65 трансактивировать экспрессию генов. Дж. Биол. хим. 275 , 3114–3120 (2000).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Collins, C. & Tzima, E. Rac[e] к полюсу: установление полярности в эндотелиальных клетках. Малые ГТФазы 5 , e28650 (2014).

    Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Newell-Litwa, K. A. & Horwitz, A. R. Миграция клеток: PKA и RhoA задают темп. Курс. биол. 21 , R596–R598 (2011).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Цима, Э. и др. Активация Rac1 посредством напряжения сдвига в эндотелиальных клетках опосредует как реорганизацию цитоскелета, так и влияние на экспрессию генов. EMBO J. 21 , 6791–6800 (2002).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Wojciak-Stothard, B. & Ridley, A.J. Поляризация эндотелиальных клеток, вызванная сдвиговым стрессом, опосредована Rho и Rac, но не Cdc42 или PI 3-киназами. J. Cell Biol. 161 , 429–439 (2003).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Цима, Э., Киоссес, В. Б., дель Позо, М. А. и Шварц, М. А. Локализованная активация cdc42, обнаруженная с помощью нового анализа, опосредует позиционирование центра организации микротрубочек в эндотелиальных клетках в ответ на напряжение сдвига жидкости. J. Biol. хим. 278 , 31020–31023 (2003 г.).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Lee, H. S. et al. Протеинтирозинфосфатаза-PEST и интегрин бета8 регулируют пространственно-временные паттерны активации RhoGDI1 в мигрирующих клетках. Мол. Клетка. биол. 35 , 1401-1413 (2015).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Head, B.P., Patel, H.H. & Insel, P.A. Взаимодействие мембранных/липидных рафтов с цитоскелетом: влияние на сигнализацию и функцию: мембранные/липидные рафты, медиаторы устройства цитоскелета и клеточной сигнализации. Биохим. Биофиз. Acta 1838 , 532–545 (2014).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Гоннорд, П., Блуэн, К.М. и Ламаз, К. Торговля мембранами и сигнализация: две стороны одной медали. Семин. Сотовый Дев. биол. 23 , 154–164 (2012).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Wan, Q., Kim, S.J., Yokota, H. & Na, S. Дифференциальная активация и ингибирование RhoA под действием напряжения сдвига, вызванного потоком жидкости, в хондроцитах. Клеточная биология. Междунар. 37 , 568–576 (2013).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Lijuan, W. et al. Интегрины опосредуют миграцию клеток HepG2, индуцированную низким напряжением сдвига. Дж. Биомед. англ. 31 , 336–340 (2014).

    Google ученый

  • Хсу, С., Такар, Р., Липманн, Д. и Ли, С. Влияние напряжения сдвига на гаптотаксис эндотелиальных клеток на поверхностях с микроузором. Биохим. Биофиз. Рез. коммун. 337 , 401–409 (2005).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Табуйо Т., Муддана Х. С. и Батлер П. Дж. Чувствительность мембран эндотелиальных клеток к напряжению сдвига зависит от липидного домена. Сотовый. Мол. биоинж. 4 , 169–181 (2011).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Wang, Y. et al. Модель роли интегринов в индуцированной потоком механотрансдукции в остеоцитах. На Bioengineering Conference, 2007 NEBC ’07 33rd Annual Northeast IEEE (IEEE, Нью-Йорк, 2007).

  • Hema, R. Циклический GMP и протеинкиназа G контролируют Src-содержащую механосому в остеобластах. науч. Сигнал. 153 , ra91 (2010 г.).

  • Сюй, В. и др. Регуляция BMP2-индуцированного внутриклеточного кальция увеличивается в остеобластах. Дж. Ортоп. Рез. 34 , 1725–1733 (2016).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Seong, J. et al. Визуализация активности Src в различных отделах плазматической мембраны с помощью визуализации FRET. Хим. биол. 16 , 48–57 (2009).

    КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Poh, Y.C. et al. Быстрая активация Rac GTPase в живых клетках силой не зависит от Src. PloS ONE 4 , e7886 (2009 г.).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Шао, С. и др. Визуализация пространственно-временной карты активации Rac в эндотелиальных клетках бычьей аорты при ламинарном и нарушенном токах. PLoS ONE 12 , e0189088 (2017).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Xiang, X. et al. Биосенсор на основе FRET для визуализации активности SYK в живых клетках. Сотовый. Мол. биоинж. 4 , 670–677 (2011).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Юра, Н. и Бар-Саги, Д. Картирование клеточных маршрутов Ras: след убиквитина. Cell Cycle 5 , 2744–2747 (2006).

    КАС Статья пабмед Google ученый

  • Chachisvilis, M., Zhang, Y.L. & Frangos, J.A. G-белковые рецепторы воспринимают напряжение сдвига жидкости в эндотелиальных клетках. Проц. Натл акад. науч. США 103 , 15463–15468 (2006 г.).

    Артикул КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  • Загрузить ссылки

    Подход на основе FRET для количественной оценки форсколин-индуцированного транспорта пендрина в плазматической мембране в бронхиальных клетках NCI h392 — Полный текст — Клеточная физиология и биохимия 2013, Vol.

    32, Доп. 1

    Справочная информация: Пендрин человека (SLC26A4, PDS) представляет собой интегральный мембранный белок, действующий как электронейтральный анионообменник. Мутации с потерей функции в белке пендрина вызывают синдром Пендреда, расстройство, характеризующееся нейросенсорной глухотой и частичным дефектом йодорганизации, которое может привести к зобу щитовидной железы. Кроме того, активация пендрина может играть роль в патогенезе ряда заболеваний, включая бронхиальную астму и хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ). Таким образом, наблюдение за численностью плазматической мембраны и перемещением pendrin в контексте живой клетки имеет решающее значение. Methods: Поступление пендрина на плазматическую мембрану контролировали с помощью флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET), физического явления, происходящего между двумя флуорофорами (FRET-донором и акцептором), расположенными в непосредственной близости друг от друга. Поскольку эффективность переноса энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором, FRET чрезвычайно чувствителен к небольшим изменениям расстояния между донором и акцептором и, следовательно, является мощным инструментом для определения белок-белковых взаимодействий. Результаты: Исследования FRET показали, что индуцированная форсколином продукция цАМФ связана со значительным увеличением экспрессии пендрина на плазматической мембране, что сопровождается снижением внутриклеточного рН. Транспозиция пендрина на мембрану сопровождается частичной деполимеризацией актинового цитоскелета за счет ингибирования Rho-GTPase. Заключение: Транспортировка на плазматическую мембрану имеет решающее значение для регуляции активности пендрина. Поэтому очень желательны надежные инструменты для мониторинга и количественной оценки этого явления.

    Введение

    Пендрин человека (SLC26A4, PDS) представляет собой мембранный белок из 780 аминокислот с 12 предполагаемыми трансмембранными доменами с транспортными характеристиками, отличными от свойств других членов семейства SLC26, поскольку он действует как натрий-независимый анионообменник, исключительно для одновалентных анионов, включая йодид, хлорид, бикарбонат, гидроксид и тиоцианат [1,2,3]. Эти биофизические свойства являются фундаментальными для множества физиологических функций транспортера и его участия во многих патологических процессах. В соответствии с этим пендрин экспрессируется в различных тканях и органах, таких как щитовидная железа, почки, внутреннее ухо, молочная железа, яички, плацента, эндометрий, легкие, амелобласты и печень [4,5,6,7]. Мутации потери функции в белке пендрина вызывают синдром Пендреда, аутосомно-рецессивное наследственное заболевание, характеризующееся тяжелой двусторонней потерей слуха, аномалиями внутреннего уха и частичным дефектом йодорганизации, что может привести к развитию эутиреоидного зоба или гипотиреоза [8,9].,10,11]. Увеличение/нарушение регуляции пендрина действительно может способствовать возникновению ряда заболеваний человека. Например, в почках пендрин может играть роль в патогенезе гипертонии, тогда как избыточная экспрессия транспортера в легких может усугублять респираторные заболевания, такие как бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ). Измененная экспрессия гена пендрина может быть частью путей передачи сигнала, характеризующих начало специфических заболеваний человека. Развитие бронхиальной астмы и ХОБЛ частично зависит от передачи сигналов, опосредованной интерлейкином-4/интерлейкином-13 (ИЛ-4/ИЛ-13), который модулирует уровень экспрессии нескольких генов, включая пендрин, посредством STAT-6 [12].

    Для комплексного понимания физиологической роли белков крайне важно разработать передовые методы мониторинга не только экспрессии генов, но и субклеточной локализации белков в контексте живой клетки. Хорошо известно, что содержание пендрина в плазматической мембране является строго регулируемым процессом. В щитовидной железе количество пендрина на уровне плазматической мембраны контролируется передачей сигналов цАМФ/ПКА [13,14]. В почках роль передачи сигналов цАМФ/PKA в регуляции экспрессии и переноса pendrin противоречива. Азроян и др. обнаружили, что кратковременная (20 мин) стимуляция пути цАМФ/ПКА увеличивает количество пендрина на клеточной поверхности, а также его транспортную активность в стабильно трансфицированных проксимальных клетках почки опоссума [15]. Другие обнаружили, что длительное (в течение ночи) повышение уровня цАМФ увеличивало содержание общего белка пендрина как в культивируемых кортикальных собирательных трубочках, так и в соединительных канальцах мышей, в то время как кратковременное (30 минут) лечение форсколином (агонистом аденилатциклазы) не изменяло белок пендрина. изобилие или его субклеточное распределение [16]. В легких цАМФ увеличивал объем и рН секретируемой жидкости за счет стимуляции активности CFTR и пендрина соответственно [17]. Вместе эти находки подчеркивают тесную связь, связывающую экспрессию генов и регулируемый внутриклеточный транспорт с функцией pendrin.

    В этом исследовании мы количественно оценили содержание пендрина на плазматической мембране в живых клетках с помощью резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). FRET — это физический процесс, при котором энергия возбужденного флуорофора (донора FRET) передается ближайшей флуоресцентной молекуле (акцептору FRET). Непременным условием для передачи энергии является непосредственная пространственная близость донора и акцептора, которая должна находиться в пределах 1-10 нм. Эта важная особенность делает FRET мощным инструментом для оценки белок-белковых взаимодействий с пространственным и временным разрешением [18] в фиксированных и живых клетках. Мы исследовали FRET между пендином (путем создания усиленного цианофлуоресцентного белка (ECFP) на С-конце пендрина, PDS-ECFP) и плазматической мембраной (используя конструкцию, содержащую усиленный желтый флуоресцентный белок (EYFP) с N-концевым соединением). тег последовательности, который посттрансляционно пальмитоилирован и направлен на плазматическую мембрану, EYFP-Mem) как в фиксированных, так и в живых бронхиальных эпителиальных клетках (NCI-h392). Наши исследования показали, что стимулированное форсколином увеличение внутриклеточного цАМФ вызывало значительное увеличение содержания пендрина на плазматической мембране. Важно отметить, что повышенный перенос пендрина на клеточную поверхность был связан со значительным увеличением обмена Cl /HCO 3 , что приводило к внутриклеточному подкислению. Более того, мы обнаружили, что внедрение pendrin в плазматическую мембрану, вероятно, облегчается стимулируемой форсколином деполимеризацией актиновых филаментов посредством Rho-GTPases.

    Материалы и методы

    Химические вещества и реактивы

    Все химические вещества были приобретены у Sigma (Sigma-Aldrich, Милан, Италия). Форсколин был от Fermentek Biotechnology. Ацетоксиметиловый эфир 2′,7′-бис(карбоксиэтил)-5(6)-карбоксифлуоресцеина (BCECF-AM), среды и сыворотки для культивирования клеток получали от Life Technologies (Life Technologies, Монца, Италия).

    Плазмиды

    Открытую рамку считывания (ORF) пендина человека из нормальной ткани щитовидной железы субклонировали с помощью ПЦР из вектора pTARGET (Promega Corporation) (первоначально предоставленного проф. П. Бек-Пеккозом, Миланский университет, Италия) в сайты рестрикции XhoI и BamHI вектора pECFPN1 (Clontech). При трансфекции в клетки млекопитающих эта конструкция приводит к продукции пендрина с С-концевой меткой ECFP.

    CFP(d)Del-EPAC(dDEPCD)-cp173Venus(d)-Venus(d) (обменный белок, активируемый зондом цАМФ (EPAC)) для мониторинга внутриклеточной концентрации цАМФ был получен от Jalink Kees [19 ].

    Конструкция Raichu-Rho-связывающего домена (RBD) была ранее описана Yoshizaki et al. [20] и любезно предоставлено профессором Мацуда (Университет Осаки, Япония).

    Конструкция pEYFP-Mem была произведена компанией Clontech. Трансфекция клеток этой конструкцией приводит к сильному мечению плазматической мембраны.

    Культура клеток и трансфекция

    Клетки NCI-h392 (от ATCC) выращивали в среде Advanced RPMI 1640 (Life Technologies, Монца, Италия) с добавлением 10% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки и 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37°C с 5% CO 2 . Клетки NCI-h392 высевали на покровные стекла диаметром 40 мм и выращивали в течение 24 часов (слияние ~80%). Для экспериментов FRET клетки временно трансфицировали плазмидами (0,4 мкг ДНК/см 2 ) с использованием трансфекционного реагента TransIT®-2020 (0,75 мкл/см 2 ) согласно протоколу, предоставленному производителем (Mirus, Mirus Bio LLC, США). Эксперименты FRET проводили через 48 часов после трансфекции.

    Измерения видеоизображения

    Для измерения FRET и внутриклеточного pH покровные стекла помещали в перфузионную камеру (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, США) и измерения проводили с помощью инвертированного микроскопа (Nikon Eclipse TE2000-S), оборудованного для измерения флуоресценции отдельных клеток и анализа изображений. Образец освещали через масляный иммерсионный объектив с увеличением 40Х (ЧА = 1,30).

    Измерения FRET

    Эксперименты FRET проводились, как описано ранее [21,22]. Вкратце, клетки NCI-h392 котрансфицировали (временно) PDS-ECFP и EYFP-Mem, Raichu-RBD для оценки активности Rho или зондом EPAC для измерения изменений цАМФ. Визуализацию клеток, экспрессирующих ECFP и/или EYFP, и обнаружение FRET проводили на инвертированном микроскопе (Nikon Eclipse TE2000-S), оснащенном монохроматором, управляемым программным обеспечением MetaMorph/MetaFluor. ECFP возбуждали при 433 нм, а EYFP при 512 нм. Все изображения были совмещены и скорректированы на фон в окнах эмиссии для FRET (535/30 нм), ECFP (475/30 нм) и EYFP (535/26 нм). Каждое изображение было дополнительно скорректировано с учетом перекрестных помех ECFP и перекрестного возбуждения EYFP. Таким образом, netFRET = IFRETbg — (ICFPbg x a) — (IYFPbg — b), где IFRETbg, ICFPbg и IYFPbg — значения серого пикселя с поправкой на фон, измеренные в окнах FRET, ECFP и EYFP соответственно; а и b — относительный вклад в интенсивность флуоресценции в окне FRET за счет перекрестных помех ECFP и перекрестного возбуждения EYFP соответственно. Полученные значения netFRET нормализовали по уровням экспрессии белков (NFRET=netFRETx 100/(ICFPbg x IYFPbg) 1/2 ). Интегральные значения плотности флуоресценции изображений из десяти областей интереса в каждой клетке (вблизи границы клетки) анализировали с использованием программного обеспечения MetaMorph и Microsoft Excel. Поскольку флуоресценция вариантов зеленого флуоресцентного белка чувствительна к рН [23], на FRET может влиять зависимое от пендрина внутриклеточное подкисление.

    Измерение внутриклеточного pH

    Клетки NCI-h392 нагружали 1 мкМ BCECF-AM в течение 30 минут при 37°C в среде Игла, модифицированной Дульбекко, а затем промывали раствором Рингера, содержащим (в ммоль/л): 130 NaCl, 3 KCl, 0,5 мгCl 2 , 1,2 NaHCO 3 , 10 глюкоза, 1,2 CaCl 2 , 10 HEPES, pH 7,4. BCECF возбуждали при 490 и 440 нм. Излучаемую флуоресценцию пропускали через однополосное дихроичное зеркало и фильтровали при 535 нм (Omega Optical, Brattleboro, VT, USA). Соотношение интенсивности флуоресценции BCECF калибровали в конце каждого эксперимента с помощью калибровочного раствора, содержащего 10 мкМ нигерицина и высокое содержание калия (в ммоль/л: 5 NaCl, 130 KCl, 0,1 MgCl 2 , 10 глюкоза, 1,2 CaCl 9029).3 2 , 10 HEPES, pH 5,30–8,44, доведенный KOH или HCl) [24]. Колебания pH (ΔupH) рассчитывали с помощью (pHf-pH0)/pH0, где pH0 — это pH до стимуляции форсколином, а pHf — максимальное значение pH, достигаемое после стимуляции форсколином.

    Окрашивание актином

    Клетки NCI-h392 выращивали на покровных стеклах диаметром 12 мм, не обрабатывали или стимулировали форсколином (100 мкМ в течение 45 минут) и фиксировали 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 20 минут. Клетки промывали 3 раза по 5 минут в PBS и пермеабилизировали 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 минут. Актиновый цитоскелет визуализировали путем инкубации с изотиоцианатом фаллоидин-тетраметилродамина (Phalloidin-TRITC, 100 мкг/мл) в течение 45 минут. Покровные стекла помещали на предметные стекла с монтажной средой Mowiol (Sigma-Aldrich, Милан, Италия) и анализировали с помощью конфокального микроскопа (Leica TCS SP2, Leica Microsystems, Heerbrugg, Швейцария).

    Статистический анализ

    Данные представлены как средние значения ± SEM. Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента (непарного или парного, если применимо) с p<0,05, считающимся статистически значимым, и где n представляет количество клеток.

    Результаты

    Количественное определение количества пендрина на плазматической мембране с помощью исследований FRET

    Для количественного определения количества пендрина, экспрессируемого на плазматической мембране, мы применили метод, основанный на физическом процессе FRET в фиксированных и живых клетках. Как указано выше, ECFP функционировал как донор FRET, а EYFP — как акцептор FRET. NCI-h392 клетки котрансфицировали конструкциями, содержащими пендрин, меченный на С-конце ECFP (PDS-ECFP), и EYFP-Mem (состоящий из слитого белка, состоящего из EYFP, меченного на N-конце 20 аминокислотами нейромодулина, которые содержат пост -трансляционный сигнал пальмитоилирования, который направляет конструкцию на плазматическую мембрану [21,25]). Для возникновения FRET два гибридных белка должны находиться в непосредственной близости друг от друга, т. е. пендрин вставлен в плазматическую мембрану или расположен близко к ней (рис. 1А) [26]. Чтобы оценить и проверить чувствительность этого подхода, NFRET был рассчитан в фиксированном NCI-h39. 2 клетки, обработанные в течение 45 минут форсколином (100 мкМ), активатором передачи сигналов цАМФ/ПКА, который, как известно, регулирует внутриклеточную локализацию и функцию пендрина [13, 14, 15, 17] или носителем (контроль). По сравнению с необработанными клетками сигнал FRET был значительно повышен в клетках, обработанных форсколином (100 ± 2,73, n = 104 и *129,1 ± 5,32, n = 123 для контрольных и обработанных форсколином клеток, соответственно, где *p <0,0001) (рис. 1Б). Это открытие согласуется с увеличением содержания пендрина на плазматической мембране при активации пути передачи сигнала цАМФ/ПКА.

    Рис. 1

    A, схематическая модель FRET между слитым белком PDS-ECFP (донор) и EYFP-Mem (акцептор). ECFP слит с С-концом пендрина (PDS), а EYFP прикреплен к клеточной мембране своим липидным якорем. FRET происходит только в том случае, если два белка находятся на расстоянии 1-10 нм. B, репрезентативная клетка, показывающая сигнал FRET под контролем (CTR) и стимуляция форсколином (FK, 100 мкМ в течение 45 минут). Гистограммы (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) представляют изменения NFRET между контрольными (CTR) и обработанными форсколином (FK) клетками. C, динамические эксперименты FRET. Интенсивность флуоресценции в канале FRET при возбуждении на длине волны 433 нм. Регистрировали интенсивность флуоресценции в реальном времени и рассчитывали (F1-F0)/F0 (см. результаты). Исходные записи являются репрезентативными для сверхэкспрессирующих PDS и фиктивных клеток.

    Динамическое перемещение пендрина к плазматической мембране было дополнительно исследовано в живых клетках. Изменения интенсивности флуоресценции в канале FRET (коэффициент эмиссии 535/475 нм), излучаемого при возбуждении на длине волны 433 нм (рис. 1C), оценивали с помощью визуализации эпифлуоресценции одиночных клеток и количественно оценивали по отношению к уровням, обнаруженным до стимуляции форсколином, измеряя максимальное изменение F1-F0)/F0, где F0 — средняя интенсивность флуоресценции в FRET-канале до стимуляции форсколином, а F1 — средняя интенсивность флуоресценции в FRET-канале после стимуляции форсколином в течение 5 мин. (F1-F0)/F0 увеличился на 27,50% ± 1,5 (n=56, p<0,0001) в клетках, экспрессирующих пендирин. В клетках, трансфицированных только EYFP-Mem и ECFP (ложные клетки), не было обнаружено значительных изменений в (F1-F0)/F0.

    Оценка активности пендрина путем измерения внутриклеточного pH в режиме реального времени

    В большинстве секретирующих эпителиальных клеток HCO 3 пендрин играет роль в модуляции pH секретируемой жидкости [17]. Секреция HCO 3 через пендрин сопровождается внутриклеточным закислением [27]. Чтобы оценить, соответствует ли повышенное содержание пендрина на плазматической мембране при активации цАМФ/ПКА увеличению его активности, были проведены измерения внутриклеточного рН в реальном времени. С этой целью NCI-h392 клетки, трансфицированные PDS-ECFP, нагружали рН-чувствительным красителем BCECF-AM (1 мкМ в течение 30 мин). Стимуляция форсколином приводила к значительному внутриклеточному подкислению в клетках с гиперэкспрессией пендрина, тогда как в нетрансфицированных клетках (ложные клетки) не было обнаружено значимых изменений внутриклеточного pH (ΔupH = 0,074 ± 0,011, n = 43 и *0,301 ± 0,018, n = 35 для ложных и PDS-трансфицированных клеток соответственно, где *p < 0,0001) (рис. 2). Эти наблюдения согласуются с увеличением функции пендрина после активации передачи сигналов цАМФ/ПКА.

    Рис. 2

    Репрезентативные экспериментальные записи, показывающие влияние стимуляции форсколином (ФК, 100 мкМ в течение 5 минут) на внутриклеточный рН в клетках, сверхэкспрессирующих пендрин, и в имитациях клеток. На вставке гистограммы (среднее значение ± стандартная ошибка среднего) представляют изменение внутриклеточного pH (ΔupH) после стимуляции форсколином (*p <0,0001).

    Участие белков Rho в качестве нижестоящих эффекторов пути передачи сигнала цАМФ/ПКА

    Ремоделирование актина имеет фундаментальное значение для контроля переноса и клеточного распределения различных каналов и транспортеров [28,29]. Для дальнейшего исследования молекулярного механизма, контролирующего клеточную локализацию пендрина после стимуляции форсколином, мы оценили: 1) концентрации цАМФ, 2) активность Rho и 3) реорганизацию актинового цитоскелета. Клетки NCI-h392 трансфицировали сенсором FRET, включающим связывающую цАМФ последовательность EPAC, расположенную между ECFP и EYFP [30]. Связывание цАМФ с EPAC вызывает внутримолекулярное конформационное изменение, приводящее к увеличению расстояния между донором и акцептором FRET, тем самым уменьшая сигнал FRET (рис. 3А). По сравнению с клетками, обработанными носителем (CTR), стимуляция форсколином снижала расчетные значения NFRET (100 ± 4,2, n = 54 и *77 ± 3,46, n = 51 для клеток, обработанных CTR и форсколином, соответственно, где *p < 0,0001). ), что согласуется со значительным увеличением внутриклеточной концентрации цАМФ и последующей активацией PKA (рис. 3B).

    Рис. 3

    A, схематическая модель зонда FRET, содержащего последовательность связывания цАМФ EPAC, расположенную между ECFP (донор) и EYFP (акцептор). Связывание цАМФ с EPAC приводит к внутримолекулярному стерическому конформационному изменению, вызывающему значительное увеличение расстояния между флуоресцентным донором и акцептором, тем самым уменьшая FRET. B, гистограммы (среднее ± SEM) представляют изменения NFRET между контрольными (CTR) и обработанными форсколином (FK, 100 мкМ в течение 45 минут) клетками (* p <0,0001).

    ГТФаза RhoA является известной мишенью PKA. Фосфорилирование RhoA GTPase по Ser188 ингибирует ее активность за счет усиления связывания между ней и ее ингибитором Rho-GDI [31,32]. Чтобы проверить, было ли вызванное форсколином увеличение внутриклеточного цАМФ параллельным снижением активности Rho в нашей экспериментальной системе, клетки NCI-h392 трансфицировали сенсором FRET (Raichu-RBD), содержащим Rho-связывающий домен (RBD), сэндвич между ECFP и EYFP [20]. Связывание эндогенного GTP-RhoA с RBD замещает EYFP и ECFP, тем самым снижая эффективность FRET (Fig. 4A). Результаты экспериментов FRET суммированы на рис. 4B. По сравнению с клетками, обработанными носителем (CTR), стимуляция форсколином значительно увеличивала сигнал NFRET, что согласуется со снижением активности RhoA (100 ± 3,64, n = 102 и *113,8 ± 4,16, n = 109).для клеток, обработанных CTR и форсколином, соответственно, где * p <0,05) (фиг. 4B). Ингибирование Rho действительно связано с деполимеризацией актина [32,33,34]. Исследования конфокальной визуализации подтвердили, что стимуляция клеток NCI-h392 форсколином вызывала значительное уменьшение количества актиновых филаментов, что согласуется с реорганизацией актинового цитоскелета (Fig. 5).

    Рис. 4

    A, схематическая модель датчика FRET, содержащего Rho-связывающий домен (RBD), зажатый между ECFP (донор) и EYFP (акцептор). Связывание GTP с RBD приводит к внутримолекулярному конформационному изменению, вызывающему значительное увеличение расстояния между флуоресцентным донором и акцептором, тем самым уменьшая FRET. B, гистограммы (среднее ± SEM) представляют изменения NFRET между контрольными (CTR) и обработанными форсколином (FK, 100 мкМ в течение 45 минут) клетками (* p <0,05).

    Рис. 5

    Влияние стимуляции форсколином на реорганизацию актина в клетках NCI-h392. Клетки обрабатывали носителем (CTR) или стимулировали форсколином (FK, 100 мкМ в течение 45 мин). F-актин окрашивали фаллоидином-ТРИТЦ и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии.

    Обсуждение

    В этом отчете мы описали основанный на FRET подход к оценке количества пендрина на плазматической мембране в культуре клеток бронхиального эпителия (NCI-h392), стимулированных форсколином. Недавние исследования показали, что не только потеря функции, но и активация активности пендина могут играть ключевую роль в возникновении ряда заболеваний у человека [5], что обуславливает необходимость в надежных инструментах для количественного определения экспрессируемого через мембрану пендина при различные патофизиологические состояния. Технология FRET была впервые описана как мощный инструмент для изучения белок-белковых взаимодействий в живых клетках [35]. Позже стало очевидно, что FRET можно также применять для измерения широкого спектра клеточных ответов, таких как изменения внутриклеточных концентраций кальция и металлов, рН, напряжения, активности ферментов и локальных изменений концентрации вторичных мессенджеров [36,37].

    Здесь, используя датчик FRET цАМФ на основе EPAC, мы подтвердили, что форсколин, известный активатор аденилатциклазы, вызывает значительное снижение NFRET, что согласуется с увеличением внутриклеточных уровней цАМФ в клетках NCI-h392 (рис. 3). ). Чтобы оценить специфические и дискретные изменения количества пендринов на клеточной поверхности, мы использовали акцептор FRET, генетически сконструированный для нацеливания на плазматическую мембрану (EYFP-Mem). Этот специфический флуоресцентный датчик обеспечивает количественную индикацию распределения мембранных белков с высоким пространственно-временным разрешением. Мы продемонстрировали, что форсколин значительно увеличивал сигнал FRET как в фиксированных (рис. 1B), так и в живых (рис. 1C) NCI-h39.2 клетки, совместно экспрессирующие EYFP-Mem и PDS-ECFP (рис. 1А), что согласуется с увеличением экспрессии пендрина на плазматической мембране. В соответствии с ролью секреции HCO 3 в эпителиальной ткани дыхательных путей [17], увеличение содержания пендрина, которое мы обнаружили на клеточной мембране, сопровождалось значительным внутриклеточным подкислением (рис. 2). Аналогично тому, что показано в щитовидной железе и почках [14,15], наши данные показывают, что стимуляция пути передачи сигнала цАМФ также увеличивает количество пендрина, экспрессируемого на клеточной поверхности, и его транспортную активность в культивируемых бронхиальных NCI-h39. 2 клетки. Транспозиция пендрина на клеточную мембрану, вероятно, регулируется PKA, поскольку мутация предполагаемого сайта фосфорилирования PKA (T717A) приводит к уменьшению транслокации транспортера на плазматическую мембрану в ответ на форсколин в клетках щитовидной железы [14]. Будут проведены дальнейшие исследования, чтобы выяснить, играет ли фосфорилирование PKA роль в регуляции локализации и функции пендрина в клетках бронхиального эпителия. Чтобы обеспечить дальнейшее понимание молекулярных сигналов, контролирующих клеточное распределение пендрина, мы сосредоточились на Rho-GTPases, которые являются специфическими нижестоящими мишенями каскада цАМФ/PKA и модулируют события внутриклеточного переноса [32,38,39].,40]. Белки семейства Rho (Rho, Rac и Cdc42) активны в своем GTP-связанном состоянии и неактивны в своем GDP-связанном состоянии [38]. Ранее мы продемонстрировали, что стимуляция форсколином приводит к значительному увеличению фосфорилирования RhoA в S188, посттрансляционной модификации, которая стабилизирует неактивную форму RhoA. После фосфорилирования RhoA с помощью PKA, Rho действительно может отделяться от своих нижестоящих эффекторов, таких как Rho-kinase и белки ERM [28,32,41,42]. Используя специальный зонд FRET, созданный для измерения активности Rho [20], мы показали, что стимуляция форсколином связана со значительным снижением активности Rho (рис. 4). Ослабление активности Rho, как было показано, способствует частичной деполимеризации актинового цитоскелета, что можно считать основной предпосылкой, облегчающей внутриклеточный перенос белков [32,43,44]. Соответственно, стимуляция NCI-h392 клеток с форсколином приводили к значительной реорганизации актинового цитоскелета (рис. 5). Насколько нам известно, это первый отчет, показывающий участие передачи сигналов Rho в клетках NCI-h392 при стимуляции цАМФ/PKA. Влияют ли белки Rho прямо или косвенно на клеточное распределение pendrin посредством деполимеризации актина, еще предстоит исследовать.

    В заключение, здесь мы предлагаем основанный на FRET подход для количественного определения экспрессии пендрина на плазматической мембране в фиксированных и живых NCI-h39. 2 клетки. Этот флуоресцентный анализ имеет высокое пространственно-временное разрешение, точен, гибок с точки зрения времени инкубации и может применяться в нескольких клеточных моделях для отслеживания даже незначительных изменений экспрессии пендрина на плазматической мембране в режиме реального времени.

    Конфликт интересов

    У авторов нет конфликта интересов, о котором следует заявить.

    Благодарности

    Это исследование финансировалось за счет грантов Университета Бари, Италия (Идея Джовани, 2011 г.) и проектов PRIN (Исследовательская программа национального интереса) для Г. Таммы (Tamma01373409Прин). C. Nofziger поддерживается Программой стипендий Roche Postdoc (№ 231). Эта работа была дополнительно поддержана грантами FWF (P18608) и FP-7 (PIRSES-GA-2008-230661) М. Паульмихлу.

    Лицензия открытого доступа: Это статья открытого доступа, лицензированная в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial 3.0 Unported (CC BY-NC) (www. karger.com/OA-license), применимой к онлайн-версии только статья. Распространение разрешено только в некоммерческих целях.
    Дозировка препарата: авторы и издатель приложили все усилия, чтобы гарантировать, что выбор препарата и дозировка, указанные в этом тексте, соответствуют текущим рекомендациям и практике на момент публикации. Тем не менее, в связи с продолжающимися исследованиями, изменениями в правительственных постановлениях и постоянным потоком информации, касающейся лекарственной терапии и реакций на лекарства, читателю настоятельно рекомендуется проверять вкладыш в упаковке для каждого лекарства на предмет любых изменений в показаниях и дозировке, а также для дополнительных предупреждений. и меры предосторожности. Это особенно важно, когда рекомендуемый агент является новым и/или редко используемым лекарственным средством.
    Отказ от ответственности: заявления, мнения и данные, содержащиеся в этой публикации, принадлежат исключительно отдельным авторам и участникам, а не издателям и редакторам. Появление рекламы и/или ссылок на продукты в публикации не является гарантией, одобрением или одобрением рекламируемых продуктов или услуг или их эффективности, качества или безопасности. Издатель и редактор(ы) отказываются от ответственности за любой ущерб, нанесенный людям или имуществу в результате любых идей, методов, инструкций или продуктов, упомянутых в содержании или рекламе.

    ISO-NE беспокоится о надежности по мере приближения зимы

    Цена на углерод рассматривается как наиболее эффективный способ достижения целей экологически чистой энергии

    Тимоти МакКуистон, Vermont Business Magazine Президент и главный исполнительный директор ISO New England — это надежность сети. ISO «отвечает за обеспечение электроснабжения шести штатов Новой Англии и за то, чтобы регион имел надежную оптовую электроэнергию по конкурентоспособным ценам сегодня и в будущем».

    Прошлой зимой компания ISO из Холиока, штат Массачусетс, столкнулась с трудностями. Сильные похолодания в декабре и январе привели к опасениям веерных отключений электроэнергии. Новая Англия непропорционально зависит от электроэнергии, вырабатываемой за счет природного газа. Но домашнее отопление имеет бабки на газе. Чтобы компенсировать разницу, ISO запустила заводы по сжиганию нефти.

    Угроза веерных отключений электроэнергии оказалась просто пугающей, но похолодание стало дорогостоящим напоминанием об ограниченности поставок природного газа. Из-за ограничений в системе трубопроводов Новая Англия не может насытиться ею.

    Генеральный директор ISO-NE Гордон ван Вели на конференции REV. фото ВБМ.

    Ван Вели во время основного доклада на конференции REV в Южном Берлингтоне 18 октября сказал собравшейся аудитории, что в тот холодный период Новая Англия сожгла 2 миллиона баррелей нефти за две недели. Новая Англия обычно потребляет около миллиона баррелей в год. Уголь является еще одним потенциальным заменителем природного газа.

    В целом, по словам Ван Вели, надежность сети довольно высока. Ван Вели родом из Южной Африки, и вам не нужно прислушиваться, чтобы это услышать.

    За последние годы линии электропередач претерпели ряд модернизаций, в том числе в Вермонте. Энергоэффективность в настоящее время является официальным энергетическим ресурсом, поскольку регион потребляет меньше электроэнергии, а возобновляемые источники энергии оказывают значительное влияние.

    Пик общего потребления пришелся на 2005 год, и с тех пор он снизился, за исключением резкого падения во время Великой рецессии, за которым последовал однократный рост по мере восстановления экономики.

    В то время как в Новой Англии самые высокие тарифы на электроэнергию в стране, этот регион находится в середине рейтинга по счетам за электроэнергию для населения; У Вермонта пятое место среди самых низких счетов за электроэнергию для жилых помещений среди всех штатов страны.

    Распределенная энергия, включая домашние солнечные батареи, стала более надежной. Нью-Гэмпшир и Мэн, возможно, отражающие их более консервативную политику, чем остальная часть региона, имеют незначительное производство солнечной энергии, а Вермонт присоединился к очагу штатов, производящих солнечную энергию, на юге Новой Англии.

    Том Данн, президент и главный исполнительный директор Vermont Electric Power Company, представил Ван Вели на конференции REV. Ван Вели пользуется уважением в регионе. В переполненном зале, собравшемся послушать выступление Ван Вели, были не только Данн из лидеров энергетики Вермонта, но и Мэри Пауэлл, генеральный директор Green Mountain Power, и Дон Рендалл, 9 лет.03:25 Генеральный директор Vermont Gas.

    Наряду с похвалой Ван Вели и ISO-NE Данн упомянул, что они «не всегда соглашаются». Несомненно, местные жители кивали головами.

    Данн позже сказал VBM, что проблема VELCO с ISO-NE в основном заключалась в том, как ISO ранее рассчитывала влияние солнечной энергии и усилий по сохранению.

    «Мы посчитали, что оценка энергоэффективности была слишком низкой», — сказал он, как и в случае солнечной фотоэлектрической генерации.

    Ван Вели признал, что это действительно так.

    Солнечная «утиная кривая». График ИСО.

    Ван Вели подробно рассказал о «утиной кривой» солнечной фотоэлектрической энергии в регионе. В летние месяцы солнечные фотоэлектрические системы значительно снизили потребность в электроэнергии для базовой нагрузки в середине дня. Это было хорошо, сказал он, так как кондиционер включился.

    Но трудность возникла ближе к вечеру, когда было еще жарко, и у людей горел переменный ток, а фотоэлектрическая солнечная энергия быстро ослабевала. В этот момент ISO-NE должна увеличить традиционную выработку электроэнергии, чтобы удовлетворить последние потребности, что само по себе является проблемой.

    Тем временем атомная энергетика, в которой только две действующие станции в Новой Англии в будущем, по-прежнему представляет собой жизненно важный компонент базовой нагрузки. Millstone в Коннектикуте — это электростанция мощностью 2111 МВт, а Сибрук, штат Нью-Гемпшир, — электростанция мощностью 1250 МВт. Pilgrim в Плимуте, штат Массачусетс, планируется закрыть в следующем году с паспортной мощностью 677 МВт. Для сравнения, Vermont Yankee была электростанцией мощностью 605 МВт.

    Итак, Ван Вели сказал, что экономическое состояние этих электростанций важно для надежности электроснабжения в регионе.

    Ван Вели заявил во время конференции REV, что цена на углерод будет наиболее эффективным способом достижения целей в области экологически чистой энергии, но решение об этом должны принимать политики. Он сказал, что ИСО будет работать со штатами для достижения этих целей.

    «Цена на углерод, я думаю, будет иметь большое значение для поддержки существующего атомного флота в регионе…. Если вы посмотрите на профиль зимней энергии, два оставшихся атомных блока производят четверть всей энергии в регионе».

    Последствия закрытия любой из атомных электростанций окажут глубокое влияние на энергетический портфель региона и подорвут цели штатов по сокращению выбросов углерода, сказал он.

    «Одним из способов решения этой проблемы, — сказал Ван Вели, — является установление реальной цены на выбросы углерода, и я думаю, что это соответствует более широким целям, поставленным политиками, по обезуглероживанию экономики к 2050 году».

    Даже в Вермонте политические лидеры проявляют лишь скромный интерес к введению налога на выбросы углерода в любой форме.

    Губернатор Фил Скотт категорически против. Демократическое руководство в Законодательном органе поддерживает его, но рядовые законодатели менее заинтересованы из-за затрат для избирателей.

    Генераторы атомных электростанций утверждают, что они должны получать компенсацию за их безуглеродные экологические характеристики. Налог на выбросы углерода может также поддержать возобновляемые источники энергии. Это помогло бы выровнять структуру затрат между источниками, что сторонники налога на выбросы углерода называют «истинной стоимостью углерода».

    Ядерная промышленность хочет ввести налог на выбросы углерода, потому что ядерная энергия является дорогим источником энергии, производящим относительно мало углерода, даже при добыче полезных ископаемых и транспортировке.

    Но ядерная энергия не может конкурировать на рынке с более дешевым природным газом в Новой Англии и нефтью или углем почти везде.

    Компания Entergy закрыла Vermont Yankee в декабре 2014 года не из-за возмездия за оппозицию бывшего губернатора Питера Шумлина атомной электростанции в Верноне, а потому, что она терпела убытки.

    Штат Нью-Йорк был вынужден умолять и предлагать помощь в размере 17,6 миллиардов долларов, чтобы поддерживать работу трех убыточных заводов в северной части штата. Губернатор Куомо хочет сохранить сотни рабочих мест и безуглеродную энергетику в качестве «моста» к возобновляемым источникам энергии.

    Выбросы углерода в Вермонте растут, и они уже не достигли первоначальных целей (25-процентное сокращение 1990 уровней к 2012 г.), и представляется маловероятным достижение будущих целей (на 40% ниже к 2030 г.), если только не произойдет экстраординарных изменений в текущих условиях.

    Выбросы углерода в Вермонте достигли своего пика в 2004 году, а затем резко упали, что позволило бы достичь целей 2012 года, если бы снижение продолжалось. Но это не так. Выбросы сократились, а затем, в 2013 году, выбросы углерода в Вермонте начали расти.

    Хотя, кажется, никто точно не знает почему, спекуляции сосредоточены на поведении потребителей.

    После окончания Великой рецессии произошли две вещи: потребители стали более уверенными в себе, и цены на нефть упали. Автомобили меньшего размера стали менее популярными, так как в стране развился больший интерес к внедорожникам (Ford намерен отказаться почти от всего своего парка автомобилей меньшего размера). Отопление домов также увеличилось.

    Линия тренда выбросов углекислого газа начала расти до того, как компания Vermont Yankee прекратила производство электроэнергии.

    Использование энергии в Новой Англии. График ИСО.

    Часть будущего решения энергетических потребностей региона, по словам Данна, будет включать более широкое использование накопителей энергии.

    GMP, например, продвигает аккумуляторные батареи как дома, так и на крупных солнечных электростанциях.

    Данн отметил, что старомодные накопители энергии также могут быть частью инновационного будущего. Например, по его словам, большие водохранилища в западном Массачусетсе включаются по мере необходимости, обеспечивая значительную гидроэнергию во время пиковых явлений.

    Вода закачивается в резервуары («насосное хранилище») во время низкой потребности в энергии, а затем находится в ожидании, когда она понадобится. Два объекта, построенные в 1970-е могут обеспечить мощность почти 2000 МВт в течение 10 минут.

    Хотя это краткосрочное решение всплеска потребности в электроэнергии, оно также является мощным, которое более чем в три раза превышает объем производства Vermont Yankee.

    Проблемы с длинной передачей

    Бывший губернатор Петр Шумлин отдельно имел претензии к ISO-NE. Шумлин, как известно, поддерживал развитие ветроэнергетики на хребте по всему штату. Ветер относительно эффективен с точки зрения затрат, но также создает ряд практических и политических проблем.

    Шумлин был разочарован ISO-NE из-за того, что он не забрал всю имеющуюся в Вермонте ветровую генерацию, тем самым сократив доходы владельцев, с одной стороны, и, с другой стороны, используя то, что он считал менее желательными источниками энергии, такими как ядерное топливо и ископаемое топливо.

    В июле 2013 года Шумлин отправил Ван Вели письмо по поводу ветряной электростанции GMP в Лоуэлле: «Я пишу, чтобы выразить свою обеспокоенность решением ISO New England сократить производство энергии Kingdom Community Wind во время жары на прошлой неделе. Хотя я понимаю миссию ISO-NE по обеспечению надежности, я призываю вас обеспечить ее выполнение с четким учетом целей экологически чистой энергетики Вермонта и региона. Как вы знаете, штат Вермонт внедрил политику, направленную на увеличение производства чистых, местных, возобновляемых источников энергии, включая ветер. Сокращение ISO-NE возобновляемых ресурсов в то время, когда вместо этого требовалось вырабатывать энергию из наших самых старых и самых грязных источников энергии, чтобы взять на себя бремя во время пикового использования энергии, противоречит этим целям».

    Ван Вели ответил Шумлину в августе того же года, сказав: «Решения GMP относительно местоположения, проектирования, строительства и взаимосвязи его проекта KCW привели к тому, что ISO потребовала сократить объемы производства проекта, чтобы сохранить надежность».

    GMP впоследствии установила конденсатор стоимостью 10 миллионов долларов в надежде развеять опасения ISO-NE относительно надежности.

    Представитель GMP Кристин Келли сообщила VBM, что конденсатор «в значительной степени решил проблему».

    По ее словам, несмотря на то, что по-прежнему существует некоторое сокращение ISO или даже из-за льда на лопастях, выработка энергии KCW достигает своих целей и является экономически эффективным поставщиком электроэнергии для крупнейшей коммунальной службы штата.

    Van Welie всегда делает ставку на надежность всей системы. Ветер, даже в хороший день, может быть прерывистым и передается по линиям электропередач далеко от наибольшей потребности в южной части Новой Англии.

    Удаленный характер ветра — в отличие от солнечной, которая в основном локальна — также создает проблему для VELCO. Линии электропередачи дороги в строительстве и обслуживании. По словам Данна, прокладка новой линии в отдаленной от сети сельской местности может сделать получаемую в результате электроэнергию слишком дорогой.

    Шумлин также столкнулся с противодействием ветряных электростанций со стороны местных жителей и некоторых защитников окружающей среды (другие, такие как Исследовательская группа общественных интересов Вермонта и Билл МакКиббен из Миддлбери и его 350.org, поддерживают большой ветер).

    Ветряные турбины мешают обзору и создают то, что противники называют нездоровым шумовым загрязнением.

    Новые стандарты уровня шума, принятые в Вермонте в прошлом году, скорее всего, сделают невозможными новые крупные ветровые разработки.

    Новая гидроэлектростанция из Квебека также создает проблемы с трансмиссией, так как проходит сотни миль.

    Данн, как и многие другие, скептически относится к плану возобновляемых источников энергии штата Массачусетс, который в прошлом году выставил заявки на более чем 1000 МВт энергии.

    После того, как предложение по линии электропередач в Нью-Гэмпшире было отклонено из-за проблем с разрешением, в марте прошлого года был выбран вариант с подключением к возобновляемым источникам энергии в Квебеке в штате Мэн.

    В то время как сила линии Мэн заключается в том, что она дешевле, чем некоторые другие предложения, на уровне 950 миллионов долларов по сравнению с 1,1 миллиарда долларов для National Grid (через Северо-восточное Королевство из Квебека по пути в Нью-Гэмпшир) и 1,6 миллиарда долларов для TDI и Eversource. (Нью-Гэмпшир), ему все еще нужно несколько разрешений, и время, похоже, уходит.

    План TDI предусматривает прокладку линии электропередачи на 100 миль под озером Шамплейн, а затем поворот налево через существующую полосу отчуждения в Вермонте.

    Из-за сомнительного характера плана в штате Мэн Данн не исключает, что TDI в конечном итоге получит запрос предложений от Массачусетса, но линия электропередач TDI или любой другой масштабный проект не будет построен без заключенного контракта, в этом он уверен. .

    «Они не будут строиться на спекуляциях, — сказал он.

    Конференция REV, октябрь 2018 г., отель DoubleTree by Hilton Burlington.