Д базука: Страница не найдена | Last.fm

Монки Д.Луффи Гум-Гам Базука: Превосходство

Способность капитана	Резиновый человек в кимоно
Описание	Повышает характеристики СИЛ персонажей на 1. 5x

→ Где найти Эвольверы

Тандемные атаки

символов по типу:

Взаимодействия между доменами PDZ базуки (Par-3) и фосфатидной кислотой: характеристика in vitro и роль в развитии эпителия

Mol Biol Cell.2012 г., 15 сентября; 23 (18): 3743–3753.

Университет Висконсина

Факультет клеточной и системной биологии, Университет Торонто, Торонто, ON M5S 3G5, Канада

Поступила в редакцию 7 марта 2012 г.; Пересмотрено 12 июля 2012 г .; Принято 18 июля 2012 г.

«ASCB®», «The American Society for Cell Biology®» и «Molecular Biology of the Cell®» являются зарегистрированными товарными знаками The American Society of Cell BD; являются зарегистрированными товарными знаками Американского общества клеточной биологии.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы

GUID: 5B4A72C2-02DA-4336-90A7-F4FD141AEDD5

GUID: 3EC4B08D-6F8C-449B-A497-305818363DFA

Abstract

Базука (Par-3) является консервативным регулятором полярности, который организует молекулярные сети в клетках широкого спектра типов. В эпителии он функционирует как ориентир плазматической мембраны для организации апикального домена. Bazooka представляет собой каркасный белок, который взаимодействует с белками через свои три домена PDZ (постсинаптическая плотность 95, большие диски, zonula occludens-1) и другие области. Кроме того, было показано, что Базука взаимодействует с фосфоинозитидами. Здесь мы показываем, что домены Bazooka PDZ взаимодействуют с отрицательно заряженной фосфолипидной фосфатидной кислотой, иммобилизованной на твердых субстратах или в липосомах. Для взаимодействия необходимы множественные домены PDZ, а консервативные участки положительно заряженных аминокислотных остатков, по-видимому, опосредуют взаимодействие.Повышение или снижение уровней диацилглицеролкиназы или фосфолипазы D — ферментов, которые продуцируют фосфатидную кислоту — выявляют роль фосфатидной кислоты в активности эмбрионального эпителия базуки, но не ее локализацию. Мутирующие остатки, участвующие в связывании фосфатидной кислоты, выявили возможную роль в локализации и функционировании базуки. Эти данные указывают на более тесную связь между базукой и мембранными липидами, чем считалось ранее. Ориентиры полярности базуки могут быть конгломератами белков и липидов плазматической мембраны, которые модифицируют активность друг друга для комплексного воздействия на полярность клеток.

ВВЕДЕНИЕ

Базука (Baz; Drosophila Par-3) и ее гомологи играют важную роль в поляризации эпителиальных и одиночных клеток. Через динамические взаимодействия с PAR-6 и атипичной протеинкиназой C (aPKC) Baz (Par-3) помогает определить молекулярные ассоциации с плазматической мембраной на одном полюсе клетки. Эта поляризация может направлять сборку клеточных соединений, ориентировать сети микротрубочек, регулировать актиновый цитоскелет и/или направлять перенос мембраны.В эпителии Baz (Par-3) функционирует как ориентир для организации апикального домена (rev. Nelson, 2003; Suzuki and Ohno, 2006; Goldstein and Macara, 2007; St Johnston and Ahringer, 2010).

Baz (Par-3) представляет собой каркасный белок, состоящий из трех консервативных областей: консервативная область 1 содержит N-концевой домен олигомеризации (OD), консервативная область 2 содержит три PDZ (постсинаптическая плотность 95, диски большие, zonula occludens-1 ) домены, а консервативная область 3 содержит сайт связывания aPKC (rev. Laprise and Tepass, 2011; ).Домен PDZ представляет собой универсальный модуль молекулярного взаимодействия, который может связывать белки, используя свой пептидсвязывающий карман или другие последовательности (рассмотрено в Nourry et al. , 2003). Действительно, такие взаимодействия являются неотъемлемой частью сборки функциональных ориентиров полярности Baz (rev. Laprise and Tepass, 2011). Кроме того, домены PDZ могут связывать липиды (Wu et al. , 2007; обзор Nourry et al. , 2003). Например, крысиный Par-3 PDZ2 может связывать виды фосфоинозитидов (Wu et al., 2007). Хотя задействованные ключевые последовательности не законсервированы в Baz (Wu et al. , 2007), тесная связь с передачей сигналов фосфоинозитидами является общей для Baz и Par-3 позвоночных. В частности, Baz содержит отдельный сайт связывания фосфоинозитида в своей С-концевой области ниже доменов PDZ (Krahn et al. , 2010), и было показано, что и Baz, и Par-3 взаимодействуют с липидной фосфатазой PTEN через их домены PDZ (von Stein et al. , 2005; Feng et al., 2008).

Предпочтительное связывание тандемных доменов Bazooka PDZ с иммобилизованной фосфатидной кислотой. (A) Схема База. (B–D, F–H) Обнаружение GST-антител слитых белков GST, связанных с иммобилизованными липидами: лизофосфатидная кислота (LPA), лизофосфохолин (LPC), фосфатидилинозитол (PI), фосфатидилинозитол (3) фосфат (PI(3)P) , фосфатидилинозитол (4) фосфат (PI(4)P), фосфатидилинозитол (5) фосфат (PI(5)P), фосфатидилэтаноламин (PE), фосфатидилхолин (PC), сфингозин-1-фосфат (S1P), фосфатидилинозитол (3,4 ) бисфосфат (PI(3,4)P ₂ ), фосфатидилинозитол(3,5)бисфосфат (PI(3,5)P ₂ ), фосфатидилинозитол(4,5)бисфосфат (PI(4,5)P ₂ ), фосфатидилинозитол (3,4,5)трифосфат (PI(3,4,5)P ₃ ), фосфатидная кислота (PA), фосфатидилсерин (PS).(B) Домен LL5α-PH (MultiPIP Grip) предпочтительно связывает фосфоинозитиды. (C) Отдельные домены Baz PDZ не обнаруживают связывания с липидами. (D) Baz PDZ1-3 предпочтительно связывает PA в 10-кратном диапазоне концентраций. (E) 10% SDS-PAGE и окрашивание кумасси бриллиантовым синим показывают, что белки PDZ, используемые в C и D, имели аналогичные концентрации и стабильность. (F) Преобразование аминокислотных остатков в Baz PDZ2 в остатки, ответственные за связывание фосфоинозитида в Rat PDZ2 (Wu et al. , 2007), передает активность связывания липидов.(G) Baz PDZ1-2 преимущественно связывает PA. (H) Baz PDZ2-3 также связывает липиды, но с меньшим предпочтением PA.

Фосфоинозитиды также играют центральную роль в поляризации клеток. В одиночных мигрирующих клетках передний и задний края организованы поляризацией разных видов фосфоинозитидов в ответ на внеклеточные сигналы (rev. Janetopoulos and Firtel, 2008). Точно так же поляризация видов фосфоинозитидов помогает организовать апикальные и базальные домены эпителиальных клеток (обзор в Shewan et al., 2011). Виды фосфоинозитидов регулируются липидкиназами и фосфатазами и задействуют нижестоящие эффекторы через ряд доменов, включая домены гомологии плекстрина (PH) и PDZ (рассмотрено в Shewan et al. , 2011). Следует отметить, что на эффекты фосфоинозитидов также влияют другие липиды в локальной мембранной среде (обзор Stace and Ktistakis, 2006).

Фосфатидная кислота (ФК) представляет собой отрицательно заряженный фосфолипид с двумя цепями жирных кислот, который составляет 1–4% от общего количества липидов в клетках млекопитающих.Он может быть получен из диацилглицерина с помощью диацилглицеролкиназы (DGK) или из фосфатидилхолина (PC) с помощью фосфолипазы D (PLD). Хотя для PA не существует модуля специфического связывания, белки обычно связываются с PA через кластеры открытых на поверхности положительно заряженных аминокислотных остатков. PA может рекрутировать белки на плазматическую мембрану и/или активировать ферментативную активность. PA также может влиять на кривизну мембраны из-за своей конической формы. Кроме того, PA работает в сочетании с другими сигнальными липидами, такими как фосфоинозитиды (rev. Stace and Ktistakis, 2006).Например, в нейтрофилах млекопитающих рекрутирование плазматической мембраны фактора обмена гуаниновых нуклеотидов Rac DOCK2 инициируется фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфатом (PIP ₃ ) и стабилизируется PA (Nishikimi et al. , 2009). ). У Drosophila PA участвует в транспорте апикальной мембраны во время биогенеза рабдомеров (Raghu et al. , 2009) и скорости целлюляризации эмбриона (LaLonde et al. , 2006).

Мы обнаружили, что домены PDZ Baz напрямую связывают PA in vitro.Эксперименты по картированию предполагают взаимодействие нескольких положительно заряженных участков поверхности. Манипулируя уровнями PA и мутируя положительные остатки in vivo, мы обнаружили, что PA поддерживает активность Baz в эмбриональной эктодерме. Мы предполагаем, что взаимодействия Baz-PA вносят вклад в специфическую липидную среду, важную для функции ориентиров полярности Baz.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Домены Bazooka PDZ связывают иммобилизованную фосфатидную кислоту, когда они присутствуют в тандеме

Чтобы проверить свойства связывания липидов доменов Baz PDZ, мы сначала исследовали липиды, иммобилизованные на твердых носителях, с различными очищенными глутатион S -трансферазой (GST). слитые белки.Коммерчески доступный домен LL5α-PH (MultiPIP Grip) использовали в качестве положительного контроля и наиболее прочно связывали виды фосфоинозитидов (). Напротив, эквимолярные количества Baz PDZ1, Baz PDZ2 или Baz PDZ 3 не проявляли заметного связывания с какими-либо видами липидов (4). Однако все три домена Baz PDZ в тандеме (Baz PDZ1-3) связывали липиды в той же степени, что и эквимолярные количества домена LL5α-PH, хотя Baz PDZ1-3 предпочтительно связывал PA (11). Уменьшение концентрации Baz PDZ1-3 в 10 раз по-прежнему выявляло предпочтительное связывание с PA (10).Важно отметить, что белки Baz PDZ1, PDZ2 и PDZ3 были столь же стабильны, как Baz PDZ1-3 (показаны эквимолярные количества, проанализированные с помощью SDS-PAGE), и оказались более стабильными, чем PDZ1-3, в других протестированных условиях очистки (неопубликованные данные). Более того, Baz PDZ2 приобрел свойства связывания липидов, когда неконсервативные остатки, которые, как было показано, важны для связывания Par-3 PDZ2-фосфоинозитида у крыс, были заменены остатками крыс (N452E, P518K; Wu et al. , 2007; ). В целом, эти результаты указывают на то, что домены Baz PDZ предпочтительно связывают PA, но только когда они присутствуют в тандеме.Как Baz PDZ1-2, так и Baz PDZ2-3 проявляли связывание с липидами, при этом Baz PDZ1-2 демонстрировал большее предпочтение к PA в этом анализе (2), что указывает на участие нескольких сайтов связывания.

Тандемные домены Bazooka PDZ связывают фосфатидную кислоту в липосомах

Чтобы проверить взаимодействие между доменами Baz PDZ и PA в более естественном контексте, мы провели анализы седиментации липосом. Чтобы проверить, связано ли связывание PDZ1-3-PA только с зарядом, мы инкубировали PDZ1-3 либо с PA, либо с фосфатидилсерином (PS), смешанным с фосфатидилхолином (PC) в липосомах.После седиментации липосом количество белка в осадке и супернатанте оценивали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси бриллиантовым синим. Окрашивание и количественный анализ показали, что более половины PDZ1-3 осаждалось с липосомами PA-PC, но менее 10% PDZ1-3 осаждалось с равными количествами липосом PS-PC (). Таким образом, связывание PDZ1-3-PA, по-видимому, не связано с неспецифическими ионными взаимодействиями.

Предпочтительное связывание тандемных доменов Bazooka PDZ с фосфатидной кислотой в липосомах.Использование 10% SDS-PAGE и окрашивание Кумасси бриллиантовым синим показывает распределение белков GST-PDZ (стрелки) между супернатантом (S) и осадком липосом (P) после анализов связывания липосом. Загружали равные пропорции супернатантов и осадка. Дорожки с одинаковыми маркерами вырезали из одних и тех же гелей. Обратите внимание на мигрирующие липиды в основании дорожек гранул (звездочки). Количественные оценки трех отдельных анализов связывания показаны справа. Полосы, окрашенные кумасси, были количественно оценены в ImageJ, и показана доля общего белка в осадке.Средние значения показаны со стандартными отклонениями. Белые звездочки указывают на статистически значимые различия ( p < 0,01; t тестов). (A) Baz PDZ1-3 связывает PA сильнее, чем PS. (B) PA связывает Baz PDZ1-3 сильнее, чем Baz PDZ1. (C) PA связывает Baz PDZ1-3 сильнее, чем Baz PDZ2. (D) PA связывает Baz PDZ1-3 сильнее, чем Baz PDZ3. (E) PA аналогично связывает Baz PDZ1-3 и Baz PDZ1-2. (F) PA аналогично связывает Baz PDZ1-3 и Baz PDZ2-3.

Затем мы подтвердили связывание PA Baz PDZ1, PDZ2, PDZ3, PDZ1-2 и PDZ2-3 в анализе липосом.PDZ1, PDZ2 и PDZ3 продемонстрировали значительно более низкое связывание липосом PA-PC по сравнению с PDZ1-3, который был протестирован в качестве положительного контроля в каждом анализе (1). Напротив, PDZ1-2 и PDZ2-3 имели неразличимое связывание с липосомами PA-PC по сравнению с PDZ1-3 (12). Таким образом, несколько доменов PDZ также необходимы для связывания PA в липосомных анализах. Учитывая тот факт, что GST димеризуется (Wilce and Parker, 1994), оказывается, что двух сайтов связывания PA на димерном белке GST-Baz недостаточно для связывания PA. Если предположить, что связывание опосредуется несколькими отдельными сайтами связывания, четыре (или, возможно, три) из этих сайтов могут быть минимумом, необходимым для того, чтобы димер белка Baz связывал PA. С другой стороны, наличие как минимум двух доменов PDZ в тандеме в одном и том же мономере белка Baz может быть специфической детерминантой связывания PA.

Исследования генетического взаимодействия показывают, что фосфатидная кислота поддерживает активность базуки у эмбрионов

Защитная кутикула, секретируемая из эмбрионального эпидермиса, обеспечивает считывание целостности и развития эктодермального эпителия. Зиготические мутанты baz ^Xi106 содержат материнский запас продукта гена baz , который может опосредовать раннее эпителиальное развитие.Однако этот материнский запас становится неопределяемым к стадии 12 (Tanentzapf and Tepass, 2003; наши наблюдения), и в результате этого истощения мутанты обнаруживают ряд кутикулярных фенотипов (14). Тяжесть этого фенотипического диапазона может быть изменена мутациями, затрагивающими белки, которые функционируют с Baz (Harris and Peifer, 2005; Shao et al. , 2010; Sawyer et al. , 2011). Мы исследовали два гена, ответственных за синтез PA — rdgA (кодирующий DGK) и Pld , — которые ранее были проанализированы для оценки активности PA в глазу Drosophila (Raghu et al., 2009) и культуре клеток млекопитающих (Antonescu et al. , 2010).

Ферменты, продуцирующие фосфатидную кислоту, способствуют активности базуки, но не локализации in vivo. (A) Категории фенотипов кутикулы, полученные в экспериментах. (B-D) Показана количественная оценка фенотипических диапазонов конкретных скрещиваний. Каждый набор данных представляет собой среднее значение двух отдельных экспериментов ( N = 98–406 эмбриональных кутикул на эксперимент). (B) Сверхэкспрессия DGK частично восстанавливает мутантный кутикулярный фенотип baz , но экспрессия PLD имеет минимальный эффект. baz ^Xi106 , gal4 — краткая форма для baz ^Xi106 , материнский-α4-тубулин-GAL4-VP16. (C) Снижение уровней DGK ( rdgA кодирует DGK) или PLD усиливает мутантный фенотип кутикулы baz ^Xi106 . Использовали аллели rdgA ^KS60 и Pld ^Null . (D) Комбинированное снижение DGK и PLD дополнительно усиливает мутантный фенотип кутикулы baz ^Xi106 .Комбинированное снижение DGK и PLD также усиливает фенотип кутикулы baz ^GD21 по сравнению с контрольным ауткроссом. rdgA ^KS60 и Pld ^{Нулевые аллели} использовали в каждом случае. (E) Окрашивание на Baz в baz зиготных мутантах по сравнению с их гетерозиготными братьями и сестрами со сверхэкспрессией DGK или без нее показывает, что частичное спасение кутикулярного фенотипа мутанта baz со сверхэкспрессией DGK не связано с обнаруживаемой стабилизацией материнского снабжения Белок Baz вокруг апикальной коры.Каждое изображение было собрано и настроено с одинаковыми настройками. Гистограммы ниже показывают количество пикселей для каждого значения оттенков серого для изображений, собранных с одинаковыми настройками. Число пикселей является средним для размеров выборки, указанных для каждого генотипа. Обратите внимание на более высокие значения интенсивности, образующие плечи в распределениях гетерозиготных братьев и сестер, и аналогичные формы распределений гемизиготных мутантов со сверхэкспрессией DGK или без нее.

Чтобы проверить, может ли сверхэкспрессия ферментов спасти baz мутантный фенотип кутикулы, мы экспрессировали их зиготически в baz ^Xi106 мутантах с использованием UAS-трансгенов и материнского драйвера α4tubulin-GAL4-VP16.В этой схеме спаривания популяции без экспрессии трансгена обнаруживали кутикулы, в основном состоящие из небольших остаточных слоев (1). С экспрессией DGK популяции сместились к менее тяжелым кутикулам, которые были в основном интактными, с одним-тремя отверстиями (13). Экспрессия PLD не имела заметного эффекта (), что может быть связано с разницей в уровне экспрессии или активности. Экспрессия любого фермента по отдельности не влияла на эмбриональную летальность. Кроме того, не было модификации мутантного фенотипа baz ^Xi106 при скрещивании с линией UAS-DGK, но в отсутствие GAL4.

Чтобы проверить, может ли потерю ферментов могла повысить фенотип мутантного ячестия BAZ , мы сначала сгенерировали мамы гетерозиговные для BAZ RDGA и RDGA ^KS60 или PLD ^NULL и пересекли их в дикие -тип самцов для оценки гемизиготного baz ^Xi106 мутантного потомства ( baz является X-сцепленным). Аллель baz ^Xi106 был подвергнут ауткроссингу от его балансирующего поголовья с получением матерей с аллелем baz ^Xi106 в -trans с Х-хромосомой дикого типа.Этих матерей скрещивали с самцами дикого типа, и потомство гемизиготных мутантов baz ^Xi106 демонстрировало умеренные фенотипы кутикулы, которые в основном казались нормальными или имели одно отверстие (; фенотипическое распределение мутанта baz ^Xi106 было более тяжелым из-за генетических взаимодействий с балансирной хромосомой, необходимой у матерей; Shao et al. , 2010 ). Дополнительная материнская гетерозиготность по rdgA ^KS60 или Pld ^Null существенно усиливала зиготический baz мутантный фенотип кутикулы ().Скрещивание матерей, гетерозиготных по baz ^Xi106 и rdgA ^KS60 , с самцами, гомозиготными по Pld ^Null , дополнительно усиливало фенотип (). Для подтверждения специфичности генетического взаимодействия с baz мы также тестировали генетические взаимодействия с аллелем baz ^GD21 . Пересечение матерей гетерозиготные для BAZ ^GD21 и RDGA ^{KS60 KS60 KS60 PLD NULL также расширили BAZ GD21 фенотипта мутантного кутикулы в зависимости от пересеченного контроля ().Мы скрестили мамы гетерозиготные для BAZ XI106 XI106 XI106 и PLD до мужчин гомозиготные для RDGA KS60 , но не видели никакого эффекта, как и ожидалось, как можно было бы только BAZ XI106 / г. потомство было бы смертельным и не хватает аллель rdgA , поскольку он сцеплен с Х. Оба гомозигота rdgA KS60 и Pld Null жизнеспособны во взрослом состоянии и способны к размножению сами по себе (Masai et al. , 1993; LaLonde et al., 2006). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что PA вносит вклад в активность Baz в эмбриональной эктодерме.}

Фосфатидная кислота не способствует локализации базуки

Поскольку Baz функционирует как ориентир полярности, PA может способствовать активности Baz, способствуя ее локализации. Чтобы проверить эту идею, мы исследовали материнский вклад Baz на стадии 11 у мутантов baz ^Xi106 со сверхэкспрессией DGK или без нее (используя ту же экспериментальную установку, которая частично восстановила мутантный фенотип baz ^Xi106 ).Обнаружение материнского Baz у мутантов было схожим с экспрессией DGK или без нее, как и его интенсивность по сравнению с обнаружением материнского и зиготного белка Baz у гетерозиготных братьев и сестер на тех же предметных стеклах (10). Таким образом, частичная спасательная способность DGK, по-видимому, не связана с влиянием на локализацию Baz. Вместо этого это может повлиять на деятельность ниже по течению от Baz или параллельных путей. В качестве одного кандидата мы исследовали aPKC на стадии 11 у мутантов baz ^Xi106 со сверхэкспрессией DGK или без нее, но уровни aPKC оказались одинаково сниженными в каждом случае по сравнению с соответствующими гетерозиготными братьями и сестрами (неопубликованные данные).

Для связывания фосфатидной кислоты необходимы положительно заряженные участки на доменах Baz PDZ

Чтобы дополнительно проанализировать роль связывания Baz-PA, мы сначала исследовали сайты связывания, необходимые для взаимодействия. Поскольку связывание PA обычно включает поверхностные участки положительно заряженных аминокислотных остатков (Stace and Ktistakis, 2006), мы рассмотрели участок положительных аминокислотных остатков, ранее обнаруженный в кристаллической структуре Par-3 PDZ2 крысы и участвующий в связывании фосфоинозитида (Wu ). и другие., 2007; ). Интересно, что аминокислотные остатки этого участка консервативны в Drosophila PDZ2 (10). Поскольку наши данные показывают, что каждый домен Baz PDZ вносит свой вклад в связывание PA, подобные патчи можно было бы ожидать и в других доменах. Также была определена кристаллическая структура крысиного Par-3 PDZ3 (Feng et al. , 2008), которая демонстрирует участок положительных аминокислотных остатков в аналогичной локальной конфигурации и в аналогичном общем положении в домене PDZ относительно домена PDZ3. пептидсвязывающий карман ().Аминокислотные остатки этого участка также консервативны у дрозофилы PDZ3 (). Кристаллографическая информация недоступна для PDZ1, но положительно заряженные аминокислотные остатки присутствуют после α-спирали-A и β-цепи-F (), как в Baz PDZ2 и PDZ3 (), но они не законсервированы в крысином PDZ1 () . Таким образом, каждый домен Baz PDZ, по-видимому, имеет положительный участок поверхностных аминокислотных остатков в аналогичном положении.

Картирование остатков на доменах Bazooka PDZ, ответственных за связывание фосфатидной кислоты.(A) Заполняющее пространство Cn3D представление структуры раствора крысиного Par-3 PDZ2 (база данных молекулярного моделирования [MMDB] ID: 61497; банк данных белков [PDB] ID: 2OGP) показывает отрицательно заряженные остатки красным и положительно заряженные остатки в синем. Положительно заряженный участок выделен желтым цветом, а вовлеченные остатки указаны стрелками. Поворот структуры примерно на 90° показывает относительное положение пептидсвязывающего кармана (остаток в основании кармана выделен желтым цветом, а карман также показан со вторичными структурами справа).Выравнивание последовательностей между крысиным Par-3 PDZ2 и Baz PDZ2 показано ниже, при этом консервативные остатки положительного участка выделены красным. Данные о вторичной структуре выше выравнивания основаны на структуре крысиного Par-3 PDZ2 (β-нити показаны зеленым цветом, а α-спирали отмечены синим цветом; Wu et al. , 2007). (B) Заполняющее пространство Cn3D представление структуры раствора крысиного Par-3 PDZ3 (MMDB ID: 64814; PDB ID: 2K1Z) с отрицательно заряженными остатками в красном и положительно заряженными остатками в синем.Положительно заряженный участок выделен желтым цветом, а вовлеченные остатки указаны стрелками. Поворот структуры примерно на 90° показывает относительное положение пептидсвязывающего кармана (остаток в основании кармана выделен желтым цветом, а карман также показан со вторичными структурами справа). Выравнивание последовательностей между крысиным Par-3 PDZ3 и Baz PDZ3 показано ниже, при этом консервативные остатки положительного участка выделены красным. Данные о вторичной структуре выше выравнивания основаны на структуре крысиного Par-3 PDZ3 (β-нити показаны зеленым цветом, а спирали — синим цветом; Feng et al., 2008). (C) Выравнивание последовательностей между крысиным Par-3 PDZ1 и Baz PDZ1. Данные о вторичной структуре ниже выравнивания основаны на предсказаниях вторичной структуры Baz PDZ1 с использованием инструментов предсказания вторичной структуры Jpred3, HNN, Prof, SOOPMA и PORTER (β-нити показаны зеленым цветом, а спирали — синим цветом). Положительно заряженные остатки, обнаруженные в положениях, подобных остаткам Baz PDZ2 и 3, обозначены красным. Они не сохраняются у крыс Par-3 PDZ1. (D) Мутация четырех положительных аминокислотных остатков в PDZ2 на аланин в Baz PDZ1-3 не влияет на связывание PA с липосомами.(E) Мутация четырех положительных аминокислотных остатков в PDZ2 плюс три положительных аминокислотных остатка в PDZ3 на аланин в Baz PDZ1-3 отменяет связывание PA с липосомой. Эксперименты в D и E проводились так же, как и в .

Чтобы проверить роль положительных участков в связывании PA, мы мутировали их остатки в аланин в Baz PDZ1-3, который был выделен как слитый белок GST, и протестировали на связывание PA в липосомном анализе. Мутация четырех положительных аминокислотных остатков в PDZ2 не влияла на связывание PA по сравнению с PDZ1-3 дикого типа, тестируемым вместе ().Этот результат согласуется с оставшимися в молекуле двумя сайтами связывания PA. Таким образом, три положительных аминокислотных остатка PDZ3 были дополнительно заменены на аланин. Мутация обоих участков PDZ2 и PDZ3 значительно снижала связывание PA по сравнению с немутировавшим PDZ1-3, тестируемым вместе (). Сайт связывания в PDZ1, по-видимому, имеет ограниченную PA-связывающую активность с мутациями других доменов PDZ, что согласуется с ограниченной PA-связывающей активностью только PDZ1. Эти результаты указывают на аминокислотные остатки, ответственные за связывание домена Baz PDZ с PA.

Положительно заряженные участки способствуют активности базуки и оказывают контекстно-зависимое влияние на локализацию Baz

Чтобы проверить влияние PA-связывающих областей, мы сначала проверили их влияние на корковую локализацию Baz. Корковая локализация Baz включает множество избыточных последовательностей вдоль белка (McKinley et al. , 2012). Мы провели три эксперимента, чтобы исследовать области связывания PA в конструкциях Baz с удалением других основных активностей локализации.В первых двух экспериментах мы проследили за выводами о том, что последовательности в PDZ1 и PDZ3 за пределами их карманов для связывания пептидов способствуют апикальному окружному и поверхностному рекрутированию (McKinley et al. , 2012). В частности, меченная зеленым флуоресцентным белком (GFP) конструкция с OD и удаленными всеми тремя доменами PDZ (BazΔOD, ΔPDZ1-3-GFP) не может локализоваться в коре, но добавление PDZ1 с его пептидсвязывающим карманом, мутировавшим в конструкцию (BazΔOD ,PDZ1 ^5A ,ΔPDZ2-3-GFP) или добавление в конструкцию PDZ3 с мутантным пептидсвязывающим карманом (BazΔOD, ΔPDZ1-2,PDZ3 ^5A -GFP) обеспечивает сильную кортикальную локализацию (мутации аланина в PDZ1 и Предполагается, что PDZ3 разрушает свои карманы для связывания пептидов; McKinley et al., 2012). Поскольку эти рекрутинговые активности в коре находятся за пределами пептидсвязывающих карманов PDZ1 и PDZ3 и, таким образом, охватывают PA-связывающие положительные участки, мы проверили, может ли PA усиливать их за счет коэкспрессии DGK с BazΔOD,PDZ1 ^5A , ΔPDZ2-3-GFP. или BazΔOD,ΔPDZ1-2,PDZ3 ^5A -GFP. Однако мы не наблюдали никакого влияния на уровни интенсивности или распределение белков (). В третьем эксперименте мы проверили, отвечает ли положительно заряженный участок PDZ3 за кортикальную локализацию BazΔOD,ΔPDZ1-2,PDZ3 ^5A -GFP путем дополнительной мутации остатков положительного участка на аланин (как это сделано in vitro in ). .Однако уровни и распределение этого белка были неотличимы от исходной молекулы. Результаты этих трех экспериментов, вместе с нашим анализом остаточного материнского белка Baz с экспрессией DGK (3), предполагают, что PA оказывает минимальное влияние на локализацию Baz.

Контекстно-зависимые эффекты остатков, связывающих фосфатидную кислоту, на активность и локализацию базуки in vivo. (A) Сверхэкспрессия DGK не влияет на локализацию BazΔOD,PDZ1 ^5A , ΔPDZ2-3-GFP или BazΔOD,ΔPDZ1-2,PDZ3 ^5A -GFP.Корковая локализация этих белков зависит от последовательностей в PDZ1 и PDZ3, соответственно, за пределами их пептидсвязывающих карманов (McKinley et al. , 2012). Для каждой конструкции Baz каждое показанное изображение было собрано и скорректировано с одинаковыми настройками. Интенсивность сигнала была количественно определена путем определения средних значений оттенков серого в отдельных плоскостях xy (200 на 200 пикселей). Для этих количественных оценок показаны средние значения и стандартные отклонения от указанного количества эмбрионов.(B) Мутация трех положительных аминокислотных остатков, ответственных за связывание PA с аланином в PDZ3 BazΔOD,ΔPDZ1-2,PDZ3 ^5A -GFP, не влияет на локализацию белка. Каждое показанное изображение было собрано и настроено с одинаковыми настройками. Интенсивность сигнала была количественно определена, как в A. (C) BazΔPDZ1-2 частично восстанавливает кутикулярный фенотип мутанта baz , но мутация трех положительных аминокислотных остатков, ответственных за связывание PA в PDZ3 с аланином, отменяет эту активность.Каждый набор данных представляет собой среднее значение двух отдельных экспериментов ( N = 122–393 эмбриональных кутикулы на эксперимент). (D) Baz∆PDZ1-2-GFP и Baz∆PDZ1-2,PDZ3 ^3A -GFP локализуются вокруг апикальной коры baz мутантных эпителиальных клеток, хотя Baz∆PDZ1-2,PDZ3 ^3A -GFP делает это на более низких уровнях. Каждое показанное изображение было собрано и настроено с одинаковыми настройками. Интенсивность сигнала была определена количественно, как в A. В C и D baz , gal4 является короткой формой для baz , материнский-α4-тубулин-GAL4-VP16.(E) Экспрессия Baz∆PDZ1-2-GFP и Baz∆PDZ1-2,PDZ3 ^3A -GFP с более сильным драйвером GAL4 на фоне дикого типа привела к большей разнице в их корковых уровнях. Каждое показанное изображение было собрано и настроено с одинаковыми настройками. Интенсивность сигналов определяли количественно, как в A.

Наконец, мы проверили, влияет ли сайт связывания PA PDZ3 на функцию Baz, путем его мутации и проведения экспериментов по спасению. Конструкции с отсутствующим доменом олигомеризации обладают минимальной спасательной активностью (McKinley et al., 2012). Таким образом, мы мутировали положительный участок PDZ3 в BazΔPDZ1-2-GFP, который, как ранее было показано, частично восстанавливает зиготический мутантный фенотип baz ^Xi106 (McKinley et al. , 2012). Действительно, Baz∆PDZ1-2-GFP частично спас эмбриональную летальность мутантов baz с 27,2 ± 2,2% до 17,7 ± 3,2% ( n = 4 эксперимента; по 300 эмбрионов в каждом; p < 0,01) и сместил распределение кутикулы до менее тяжелых фенотипов ().Мутация положительного участка обратила оба эффекта с летальностью 26,7 ± 1,7% ( n = 4 эксперимента, по 300 эмбрионов в каждом, p <0,01, по сравнению с Baz∆PDZ1-2) и распределением кутикулы, неотличимым от такового у Baz∆PDZ1-2. нетрансгенный контроль. Анализ мутантных эмбрионов baz показал, что обе конструкции были экспрессированы и локализованы в коре — Baz∆PDZ1-2-GFP на низких уровнях коры и Baz∆PDZ1-2,PDZ3 ^3A -GFP на несколько более низких уровнях коры. ). Экспрессия Baz∆PDZ1-2-GFP и Baz∆PDZ1-2,PDZ3 ^3A -GFP с более сильным драйвером GAL4 на фоне дикого типа приводила к еще большей разнице в их корковых уровнях (1).Мы подтвердили, что обе конструкции были вставлены в один и тот же участок хромосомы с помощью ПЦР, как это было сделано ранее (McKinley et al. , 2012). Кроме того, более низкие уровни Baz∆PDZ1-2,PDZ3 ^3A -GFP по сравнению с Baz∆PDZ1-2-GFP могут не быть связаны с общей проблемой фолдинга белка, поскольку одни и те же три аланина были мутированы в Baz∆OD,∆PDZ1- 2,PDZ3 ^5A -GFP без эффекта. Хотя неясно, почему мутация положительного участка влияет на Baz∆PDZ1-2-GFP, но не на Baz∆OD,∆PDZ1-2,PDZ3 ^5A -GFP, данные указывают на то, что сайт связывания PA PDZ3 влияет на локализацию и функцию Baz Конструкция ∆PDZ1-2-GFP.

ОБСУЖДЕНИЕ

Наши результаты выявили взаимодействие in vitro между доменами Baz PDZ и PA. Каждый домен PDZ, по-видимому, имеет положительный поверхностный участок, способный связывать PA, но для связывания PA в Baz должно присутствовать несколько сайтов. Манипулируя ферментами, ответственными за генерацию PA, и мутируя сайты связывания PA в Baz, взаимодействия Baz-PA, по-видимому, оказывают минимальное или зависящее от контекста влияние на рекрутирование Baz на плазматическую мембрану и могут влиять на последующие эффекты Baz, важные для эпителиальных клеток. структура ().

Модель роли фосфатидной кислоты в ориентирах полярности Базука. Индивидуальные белки Baz связывают PA через положительные участки на каждом из трех их доменов PDZ (помечены 1-3). Эти взаимодействия могут влиять на рекрутирование Baz на плазматическую мембрану и способствовать последующим эффектам Baz, важным для структуры эпителиальной ткани. Олигомеризация Baz по ориентирам полярности Baz приводит к локальной стабилизации и обогащению PA с образованием специализированного домена плазматической мембраны.

Способность меченых GST Baz PDZ1-3, PDZ1-2 и PDZ2-3, но не отдельных доменов PDZ, связывать PA указывает на то, что каждый домен PDZ может способствовать связыванию PA, но что димеры GST отдельных доменов PDZ недостаточно для привязки.Эти данные свидетельствуют о том, что взаимодействие связывания включает множество низкоаффинных сайтов, которые требуют тандемной организации и/или олигомеризации для эффективного взаимодействия с PA. В соответствии с этим требованием полноразмерный белок Baz содержит домен олигомеризации (Benton and St Johnston, 2003), который, как ожидается, будет образовывать расширенные мультимеры посредством взаимодействий спереди назад между положительно и отрицательно заряженными гранями домена, согласно исследованиям. гомологичного домена Par-3 млекопитающих (Feng et al., 2007). Такая расширенная олигомеризация может позволить Baz формировать платформы для вовлечения и стабилизации локальных пулов PA (16). Это также может объяснить способность PDZ3 придавать зависимую от сайта связывания PA локализацию и активность в конструкции Baz∆PDZ1-2 (4). Действительно, с удаленным доменом олигомеризации мутация сайта связывания PA PDZ3 не оказывала заметного влияния на локализацию конструкции, в которой отсутствуют PDZ1 и PDZ2.

Ожидается, что олигомеризация Baz сблизит множество партнеров по связыванию, чтобы сформировать ориентиры полярности Baz.Кроме того, было показано, что множественные избыточные сайты связывания привлекают Baz к апикальной окружности эмбриональных эктодермальных клеток Drosophila (McKinley et al. , 2012). Однако, удаляя эти сайты рекрутирования с белка или анализируя чувствительные пулы белка, было трудно найти доказательства того, что PA рекрутирует Baz на плазматическую мембрану (это было предложено в результатах одного эксперимента, но не в четырех других). эксперименты — и ). В качестве альтернативы PA может влиять на эффекты ниже по течению от Baz.Некоторые из этих эффектов могут включать параллельные пути, но способность Baz связывать PA in vitro и эффекты мутации сайта связывания PA in vivo предполагают, что PA функционирует на ориентирах полярности Baz. К сожалению, отсутствие зондов для ПА препятствует визуализации ПА в развивающихся эпителиальных клетках.

Было показано, что два из известных связывающих партнеров Baz подвержены влиянию PA в других системах — фосфоинозитиды и aPKC. Баз может напрямую связываться с липидной фосфатазой PTEN (von Stein et al., 2005) и его субстрата PIP ₃ (Krahn et al. , 2010), предполагая, что он может способствовать производству фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата (von Stein et al. , 2005; 6 Krahn

). al.

et al.

Baz также связывает aPKC для динамического формирования комплекса PAR (Wodarz et al. , 2000; Morais-de-Sá et al. , 2010; Walther and Pichaud, 2010). Интересно, что PA связывает aPKC млекопитающих (PKCζ) in vitro, а добавление PA к клеточным экстрактам активирует киназу (Limatola et al. , 1994). Точно так же экзогенная PLD может повышать активность PKCζ в клеточной культуре (Limatola et al., 1997). Совсем недавно активность DGK была связана с повышенной активностью PKCζ/ι как часть сигнального пути, связывающего фактор роста гепатоцитов с активацией Rac и вздутием мембраны в культуре клеток млекопитающих (Chianale et al. , 2010). Т.о., локальное привлечение PA к ориентирам полярности Baz потенциально может влиять на локальную активность aPKC. Было показано, что

PDZ-домены многих белков связывают фосфоинозитиды (Nourry et al. , 2003; Wu et al., 2007). Наши результаты расширяют репертуар липидов, с которыми могут связываться домены PDZ. В частности, для Baz наши данные указывают на более тесную и более сложную связь с мембранными липидами, чем считалось ранее. Т.о. ориентиры полярности Baz могут рассматриваться как конгломераты белков и липидов плазматической мембраны, которые, вероятно, модифицируют активность друг друга для комплексного воздействия на клеточную организацию.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

GST-слитые белки

Вектор pENTR, содержащий кДНК Baz (McKinley et al., 2012) использовали в качестве матрицы для ПЦР. Положения домена PDZ были предсказаны с помощью InterProScan Sequence Search (www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/), а праймеры для ПЦР были разработаны для добавления 10 аминокислотных остатков к предсказанным концам каждого домена, как это сделали другие (Tonikian и др. , 2008 г.). Праймеры для ПЦР также генерировали сайты рестрикции для клонирования в векторы pGEX 6P. Векторы и продукты ПЦР разрезали с помощью Eco RI и Xho I и лигировали с использованием лигазы Т4.Вставки подтверждали секвенированием. Праймеры и векторы перечислены в дополнительной таблице 1. Все белки были помечены GST на их N-концах.

Конструкции слитого белка GST трансформировали в DL21 Escherichia coli для экспрессии белка. Бактерии выращивали в 2 мл культуральной среды LB/ампициллин (Amp) в течение ночи при 37°C, и этот образец использовали для инокуляции 50 мл культуры LB/Amp, которую встряхивали в течение 2 ч при 28°C, индуцировали 0,1 мМ изопропил-β-d-тиогалактозида, а затем встряхивали в течение 3 ч при 28°С. Бактерии осаждали при 3500 × г в течение 20 мин при 4°С. Осадки замораживали в течение ночи, а затем ресуспендировали в 20 мл буфера PBS-T (фосфатно-солевой буфер [PBS] с 1% Triton X-100, 1 мг/мл лизоцима и смесью ингибиторов протеаз (Complete Mini, без ЭДТА). Roche, Indianapolis, IN]; одна таблетка на 7 мл, pH 7,5). Суспензии выдерживали при комнатной температуре в течение 40 мин для лизиса бактерий. После центрифугирования при 12 000 × g в течение 20 мин супернатанты пропускали через .фильтры 2 мкм. Фильтраты наносили на колонки с глутатион-агарозой (около 0,4 мл упакованных шариков; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). Проток повторно применяли к колонкам три раза. Затем колонки один раз промывали PBS-T и белки GST элюировали 1 мл элюирующего буфера (PBS с 10 мМ глутатиона, 1 мМ дитиотреитола и 15% глицерина). Чистоту определяли с помощью SDS-PAGE. Концентрацию определяли с помощью анализа белка Брэдфорда (Sigma-Aldrich).

Зондирование липидов на твердых носителях

Полоски PIP исследовали с помощью очищенных белков GST в соответствии с инструкциями поставщика (Echelon, Солт-Лейк-Сити, Юта; www. echelon-inc.com/content/EBI/product/files/PROTOCOL_Strip_Array.v9.pdf). Домен LL5α-PH (MultiPIP Grip; Echelon) использовали в качестве положительного контроля. Кроличьи антитела против GST (полученные в нашей лаборатории), вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс), реагенты для обнаружения HRP (Thermo Fisher Scientific) и система визуализации FluorChem 8900 (Alpha Innotech, Санта-Клаус). Клара, Калифорния) использовали для обнаружения белков GST.

Анализ связывания липосом

Для приготовления липосом 8 мг дипальмитоилфосфатидилхолина и 2 мг дипальмитоилфосфатидиловой кислоты или дипальмитоилфосфатидилсерина (каждый из Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) растворяли в 1 мл смеси хлороформ:метанол (1:0.4). Растворитель выпаривали газообразным азотом. Смеси липидов ресуспендировали в 1 мл буфера HBS (0,01 М 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислоты, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% сульфата Р20 [Biacore, GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ]) при перемешивании в течение 1 ч при 25°С. Затем суспензию обрабатывали ультразвуком при 80°С в течение 15 мин для получения однослойных везикул и замораживали при -20°С для последующего использования. Этот подход был основан на опубликованных исследованиях (Fang et al. , 2001; Zhao et al., 2007; Нисикими и др. , 2009). Первоначально концентрации ПА 5, 10 и 20% были протестированы в липосомах ПА:ФХ. Baz PDZ1-3 не показал обнаруживаемого связывания с 5% липосомами PA, слабого связывания с 10% липосомами PA и относительно сильного связывания с 20% липосомами PA, которые использовались в анализах в .

Для проверки связывания липосом мы смешали 40 мкл размороженной суспензии липосом с 5 мкг каждого белка GST в трис-буферном солевом растворе (TBS; pH 7,5), содержащем коктейль ингибиторов протеаз (Complete Mini, без ЭДТА; одна таблетка на 7 мл). ).К суспензии добавляли TBS, содержащий коктейль ингибиторов протеаз, до конечного объема 500 мкл, и смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Затем суспензию центрифугировали в течение 30 мин при 14000× g при комнатной температуре. После сбора супернатанта осадок четыре раза промывали 200 мкл TBS, содержащего смесь ингибиторов протеазы. Супернатант смешивали с 500 мкл метанола на вортексе, затем добавляли 125 мкл хлороформа и смесь встряхивали.Смесь центрифугировали 1 мин при 14 000 × g при 25°С и удаляли верхний водный слой. Затем добавляли 500 мкл метанола и смесь встряхивали. После центрифугирования в течение 2 мин при 14 000 × g при 25°С супернатант удаляли, а осадок высушивали с помощью SpeedVac. Осадок липосом и осажденный белок из супернатанта кипятили в течение 5 минут в буфере для образцов SDS-PAGE, и равные пропорции каждого образца разделяли с помощью 10% SDS-PAGE и окрашивали кумасси бриллиантовым синим.

Сайт-направленный мутагенез

Нуклеотиды были изменены с помощью ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза, как описано ранее (McKinley et al. , 2012). Матрицы были получены из клеток E. coli C7510, а родительские нити были разрушены с помощью Dpn I. Матрицы представляли собой описанную ранее конструкцию GST-PDZ1-3 и BazΔOD, ΔPDZ1-2, PDZ3 ^5A и BazΔPDZ1- 2, которые были созданы ранее в векторе pENTR (McKinley et al. , 2012).См. Дополнительную таблицу 2 для списка сделанных праймеров и мутаций.

Мутированный BazΔOD,ΔPDZ1-2,PDZ3 ^5A и Baz∆PDZ1-2 рекомбинировали путем клонирования Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA) в pPWG для мечения C-конца EGFP и размещения ниже промотора UASp. Сайт рекомбинации attb в сайте pPWG Nsi1 позволяет нацеливать вектор на сайт рекомбинации attp2 на хромосоме 3 у трансгенных мух (Genetic Services, Cambridge, MA).

Запасы мух и генетика

Помимо уже упомянутых, запасы включали мух UAS-DGK и UAS-PLD (дары R.Падинжат, Институт фундаментальных исследований Тата, Бангалор, Индия), baz ^Xi106 мутанты (дар А. Водара, Геттингенский университет, Геттинген, Германия), baz ^GD21 мутанты (дар Дж. Заллена, Sloan-Kettering Institute, New York, NY), rdgA ^{мутанты KS60} (#31426; Bloomington Drosophila Stock Center, Bloomington, IN,), Pld ^Null мутанты (подарок M. Frohman, St. Frohman) Университет Брука, Стоуни-Брук, Нью-Йорк) и мух без дочери (da)-Gal4 (подарок У.Tepass, Университет Торонто, Торонто, Канада). WT был желтый белый .

Рекомбинантная хромосома, содержащая материнский α4-тубулин-GAL4-VP16 (подарок М. Пайфера, Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл, Чапел-Хилл, Северная Каролина) и аллель baz ^Xi106 , обеспечивающая экспрессию конструкции в baz зиготических мутантов, как это было сделано ранее (McKinley et al. , 2012). Для генотипирования хромосому сбалансировали по FM7[twi-GAL4, UAS-GFP] (#6873; Bloomington Drosophila Stock Center), а самок скрестили с самцами с Red-Stinger (#6873; Bloomington Drosophila Stock Center). ) на Х-хромосоме и конструкции UAS на аутосомах.

Показатели эмбриональной смертности и препараты кутикулы

Для оценки эмбриональной смертности мухи откладывают яйца до 24 часов при 25°C. Отбирали 300 яиц и инкубировали в течение 48 часов. Процент невылупившихся эмбрионов определяли по сравнению с общим числом эмбрионов (исключая неоплодотворенные яйца). Для подготовки кутикулы все невылупившиеся яйца собирали, промывали, дехорионировали 50%-ным отбеливателем, помещали на предметные стекла с раствором Хойера:молочная кислота (1:1) и запекали при 60°C в течение ночи.

Окрашивание и визуализация эмбрионов

Эмбрионы промывали 0,1% раствором тритона; дехлорирован 50% отбеливателем; вымытый; фиксировали в течение 20 мин в смеси 3,7% формальдегид/PBS:гептан, 1:1; подвергают девителлинизации метанолом; заблокированы и окрашены кроличьими антителами против Baz (1:2000; получено в нашей лаборатории против GST-Baz 1-311) и вторичными антителами Alexa 647 (1:1000; Invitrogen) в PBS/1% козьей сыворотки/0,1% Triton X -100/1% азид натрия.

Дехорионированные живые эмбрионы помещали в галокарбоновое масло (серия 700; Halocarbon Products, Beech Island, SC) на чашки ПетриPERM (Sigma-Aldrich).Фиксированные эмбрионы монтировали в Aqua Polymount (Polysciences, Warrington, PA). Изображения получали с помощью конфокальной системы с вращающимся диском (Quorum Technologies, Guelph, Канада) при комнатной температуре с 63-кратным апохроматическим объективом с числовой апертурой 1,4 (Carl Zeiss, Йена, Германия), верхней пьезопластинкой, зарядом для умножения электронов. камера сопряженного устройства (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Япония) и программное обеспечение Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA).

Благодарности

Мы благодарим Джули Брилл за критику и предложения и Р.Падинжат, А. Водарз, М. Фроман, У. Тепасс, Дж. Заллен и М. Пайфер за реагенты. Эта работа была поддержана операционным грантом Канадского института исследований в области здравоохранения. Т. Харрис занимает кафедру исследований в Канаде уровня 2.

Сокращения:

Список литературы

• Antonescu CN, DANUSER G, SCHMID SL.Фосфатидная кислота играет регулирующую роль в клатрин-опосредованном эндоцитозе. Мол Биол Селл. 2010;21:2944–2952. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Benton R, St Johnston D. Консервативный домен олигомеризации у дрозофилы Bazooka/PAR-3 важен для апикальной локализации и эпителиальной полярности. Карр Биол. 2003; 13:1330–1334. [PubMed] [Google Scholar]
• Chianale F, et al. Диацилглицеролкиназа альфа опосредует HGF-индуцированную активацию Rac и взъерошивание мембран, регулируя атипичные PKC и RhoGDI.Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107:4182–4187. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Fang Y, Vilella-Bach M, Bachmann R, Flanigan A, Chen J. Опосредованная фосфатидной кислотой митогенная активация передачи сигналов mTOR. Наука. 2001; 294:1942–1945. [PubMed] [Google Scholar]
• Feng W, Wu H, Chan LN, Zhang M. NTD Par-3 принимает PB1-подобную структуру, необходимую для олигомеризации Par-3 и локализации в мембране. EMBO J. 2007; 26: 2786–2796. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Feng W, Wu H, Chan LN, Zhang M. Опосредованная Par-3 локализация соединения липидной фосфатазы PTEN необходима для установления клеточной полярности. Дж. Биол. Хим. 2008; 283:23440–23449. [PubMed] [Google Scholar]
• Goldstein B, Macara IG. Белки PAR: основные игроки в поляризации клеток животных. Ячейка Дев. 2007; 13: 609–622. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Harris TJ, Peifer M. Позиционирование и сегрегация апикальных сигналов во время установления эпителиальной полярности у Drosophila .Джей Селл Биол. 2005; 170:813–823. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Janetopoulos C, Firtel RA. Направленная чувствительность во время хемотаксиса. ФЭБС лат. 2008; 582:2075–2085. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Krahn MP, Klopfenstein DR, Fischer N, Wodarz A. Мембранное нацеливание Базука/PAR-3 опосредовано прямым связыванием с фосфоинозитидными липидами. Карр Биол. 2010;20:636–642. [PubMed] [Google Scholar]
• LaLonde M, et al. Роль фосфолипазы D в эмбриональной целлюляризации Drosophila .BMC Dev Biol. 2006; 6:60. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Laprise P, Tepass U. Новое понимание белков эпителиальной полярности у Drosophila . Тенденции клеточной биологии. 2011;21:401–408. [PubMed] [Google Scholar]
• Limatola C, Barabino B, Nista A, Santoni A. Активация интерлейкин-1-бета-индуцированной протеинкиназы C-zeta имитируется экзогенной фосфолипазой D. Biochem J. 1997; 321: 497–501 . [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Limatola C, Schaap D, Moolenaar WH, van Blitterswijk WJ.Активация фосфатидной кислотой протеинкиназы C-zeta, сверхэкспрессируемой в клетках COS: сравнение с другими изотипами протеинкиназы C и другими кислыми липидами. Биохим Дж. 1994; 304:1001–1008. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Masai I, Okazaki A, Hosoya T, Hotta Y. Drosophila дегенерация сетчатки Ген кодирует специфичную для глаза диацилглицеролкиназу с богатыми цистеином мотивами цинковых пальцев и анкирином. повторяется. Proc Natl Acad Sci USA. 1993;90:11157–11161. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• McKinley RF, Yu CG, Harris TJ.Сборка ориентиров полярности базуки через многогранный механизм мембранной ассоциации. Дж. Клеточные науки. 2012; 125:1177–1190. [PubMed] [Google Scholar]
• Morais-de-Sá E, Mirouse V, St Johnston D. Фосфорилирование aPKC базуки определяет апикальную/латеральную границу в эпителиальных клетках дрозофилы . Клетка. 2010; 141: 509–523. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Nelson WJ. Адаптация основных механизмов для создания клеточной полярности. Природа. 2003; 422: 766–774. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Nishikimi A, et al.Последовательная регуляция динамики DOCK2 двумя фосфолипидами во время хемотаксиса нейтрофилов. Наука. 2009; 324:384–387. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Nourry C, Grant SG, Borg JP. Белки домена PDZ: подключи и работай! наук СТКЭ. 2003; 2003: RE7. [PubMed] [Google Scholar]
• Raghu P, et al. Биогенез рабдомеров в фоторецепторах Drosophila остро чувствителен к уровням фосфатидной кислоты. Джей Селл Биол. 2009; 185:129–145. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Sawyer JK, Choi W, Jung KC, He L, Harris NJ, Peifer M.Сократительная актомиозиновая сеть, связанная с адгезивными соединениями с помощью Canoe/afadin, способствует конвергентному расширению. Мол Биол Селл. 2011;22:2491–508. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Shao W, Wu J, Chen J, Lee DM, Tishkina A, Harris TJC. Скрининг модификаторов взаимодействующих генов Bazooka/PAR-3 в эпителии эмбрионов Drosophila . ПЛОС ОДИН. 2010;5:e9938. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шеван А., Истберн Д.Дж., Мостов К. Фосфоинозитиды в клеточной архитектуре.Колд Спринг Харб Перспект Биол. 2011;3:a004796. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Сент-Джонстон Д. , Арингер Дж. Полярность клеток в яйцеклетках и эпителии: параллели и разнообразие. Клетка. 2010; 141:757–774. [PubMed] [Google Scholar]
• Stace CL, Ktistakis NT. Белки, связывающие фосфатидную кислоту и фосфатидилсерин. Биохим Биофиз Акта. 2006; 1761: 913–926. [PubMed] [Google Scholar]
• Suzuki A, Ohno S. Система PAR-aPKC: уроки полярности. Дж. Клеточные науки. 2006; 119: 979–987.[PubMed] [Google Scholar]
• Tanentzapf G, Tepass U. Взаимодействие между крохами, смертельными гигантскими личинками и путями базуки при поляризации эпителия. Nat Cell Biol. 2003; 5:46–52. [PubMed] [Google Scholar]
• Tonikian R, et al. Карта специфичности для семейства доменов PDZ. PLoS биол. 2008;6:e239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• von Stein W, Ramrath A, Grimm A, Muller-Borg M, Wodarz A. Прямая ассоциация Базука/PAR-3 с липидной фосфатазой PTEN выявляет связь между Комплекс PAR/aPKC и передача сигналов фосфоинозитида.Разработка. 2005; 132:1675–1686. [PubMed] [Google Scholar]
• Walther RF, Pichaud F. Crumbs/DaPKC-зависимое апикальное исключение базуки способствует ремоделированию полярности фоторецепторов. Карр Биол. 2010;20:1065–1074. [PubMed] [Google Scholar]
• Wilce MC, Parker MW. Структура и функция глутатион S -трансфераз. Биохим Биофиз Акта. 1994; 1205:1–18. [PubMed] [Google Scholar]
• Wodarz A, Ramrath A, Grimm A, Knust E. Drosophila атипичная протеинкиназа C связывается с базукой и контролирует полярность эпителия и нейробластов.Джей Селл Биол. 2000; 150:1361–1374. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wu H, Feng W, Chen J, Chan LN, Huang S, Zhang M. PDZ-домены Par-3 как потенциальные интеграторы передачи сигналов фосфоинозитидов. Мол Ячейка. 2007; 28: 886–898. [PubMed] [Google Scholar]
• Zhao C, Du G, Skowronek K, Frohman MA, Bar-Sagi D. Фосфолипаза D2, генерируемая фосфатидной кислотой, связывает стимуляцию EGFR с активацией Ras с помощью Sos. Nat Cell Biol. 2007; 9: 706–712. [PubMed] [Google Scholar]

Рисунки и данные по натяжению цитоскелета и геометрии интерфейса настройки базыки для обеспечения точности слияния и целостности листа во время дорсального закрытия (A, n = 6 эмбрионов), UAS Baz∆ (B, n = 6 эмбрионов), только UAS NLS RFP (C, n = 6 эмбрионов) или UAS Baz RNAi и UAS NLS RFP (D, n = 7 эмбрионов) в полосы.Эмбрионы на C, D также экспрессируют Utrophin GFP. Серые прерывистые линии на A, B отмечают спинное отверстие. Пурпурные стрелки на A, B показывают локализацию базуки на вновь образованных контактах между эпителиальными клетками с противоположных флангов; пурпурные стрелки (на B) указывают на выступающие полосы после слияния, а желтые стрелки (на B) указывают на неправильное расположение клеток смесителя вдоль оси A/P. Зеленые и желтые стрелки на C, D указывают соответственно на динамику ремоделирования интерфейса и Utrophin GFP, увеличенную на вставках, предоставленных рядом (увеличенная область отмечена пунктирными желтыми квадратами).

Bazooka/PAR3 необязателен для полярности фолликулярных эпителиальных клеток дрозофилы | Биология открытый

Апико-базальная полярность является определяющей характеристикой эпителиальных клеток.У Drosophila идентичность апикальной мембраны устанавливается и регулируется посредством взаимодействий между высококонсервативным комплексом Par (Bazooka/Par3, атипичная протеинкиназа C и Par6) и комплексом Crumbs (Crumbs, Stardust и PATJ). Было высказано предположение, что Базука действует на вершине генетической иерархии в установлении и поддержании апико-базальной полярности. Тем не менее, по-прежнему существует неясность в отношении правильной последовательности событий и взаимосвязей с другими путями во время этого процесса.В этом исследовании мы пересматриваем этот вопрос, сравнивая фенотипы широко используемых аллелей baz ⁴ и baz ^815-8 с фенотипами пока не охарактеризованных baz ^XR11 и нулевых аллелей в разных эпителиях Drosophila . В то время как все эти аллели baz демонстрируют идентичные фенотипы во время эмбрионального эпителиального развития, мы наблюдаем сильные различия в тяжести и пенетрантности дефектов полярности в фолликулярном эпителии: полярность в основном нормальная у baz ^EH747 и baz ^XR11 в то время как baz ⁴ и baz ^{815 -8} демонстрируют потерю полярности, сильную многослойность и потерю эпителиальной целостности во всех клонах.Дальнейший анализ показывает, что хромосомы, несущие аллели baz ⁴ и baz ^815-8 , могут содержать дополнительные мутации, усиливающие истинный baz фенотип потери функции в фолликулярном эпителии. Это исследование ясно показывает, что Baz незаменим для регуляции полярности в фолликулярном эпителии и что потребность в ключевых регуляторах клеточной полярности сильно зависит от контекста развития и типа клеток.

Определяющей характеристикой эпителиальных клеток всех многоклеточных животных является апико-базальная полярность. Его создание и поддержание необходимы для множества клеточных процессов, включая межклеточную адгезию, адгезию клеточного матрикса, транспортировку белков, форму клеток и регуляцию роста и апоптоза. Учитывая его жизненно важную роль в клеточном гомеостазе, неудивительно, что дефекты клеточной полярности могут вызывать серьезные клеточные нарушения, которые напрямую связаны с многочисленными заболеваниями, от рака до нарушения функции почек и слепоты (Martin-Belmonte and Perez-Moreno, 2012; Tepass, 2012; Родригес-Боулан и Макара, 2014).

Апико-базальная полярность в эпителиальных клетках проявляется при сборке поляризованных сетей цитоскелета, поляризованном перемещении везикул и груза и локализации комплексов адгезии в определенных местах коры. Это вызывает разделение эпителиальной плазматической мембраны на отдельные апикальные, базальные и латеральные домены, обычно обогащенные специфическими фосфолипидными компонентами и отдельными, но высококонсервативными белковыми комплексами (Johnson and Wodarz, 2003; McCaffrey and Macara, 2011; Tepass, 2012; Родригес-Булан и Макара, 2014 г. ).

В эпителиальных клетках Drosophila апикальная мембрана подразделяется на свободную апикальную мембрану и слегка базальную субапикальную область (SAR) (Bilder et al., 2000; Tepass et al., 2001; St Johnston and Ahringer, 2010; Laprise и Тепасс, 2011). SAR занимает комплекс Crumbs, состоящий из Crumbs (Crb), Stardust (Sdt), PATJ и Lin7, и комплекс Par, состоящий из атипичной протеинкиназы C (aPKC), Par6 и Bazooka/Par3 (Baz).Эти белковые комплексы имеют решающее значение для установления и поддержания апикального домена плазматической мембраны (Bilder et al., 2003; Tanentzapf and Tepass, 2003; Harris and Tepass, 2008; Franz and Riechmann, 2010). Базолатеральная плазматическая мембрана дрозофилы подразделяется на слипчивые соединения (AJs) или слипчивые зоны (ZA), латеральную мембрану и базальную мембрану. AJs являются ключевыми медиаторами межклеточной адгезии и лежат непосредственно у основания SAR. Ядро AJ сформировано комплексом кадгерин-катенин, состоящим из DE-кадгерина (DE-cad), броненосца/бета-катенина (Arm) и альфа-катенина.Кроме того, Baz, а также иммуноглобулиноподобная молекула адгезии Echinoid (Ed) и ее внутриклеточный актин-связывающий партнер Canoe (Cno) локализуются в AJ (Müller and Wieschaus, 1996; Wei et al., 2005; Harris and Tepass, 2010; Десаи и др., 2013).

Второй тип межклеточного соединения, перегородочное соединение (SJ), также располагается на латеральной мембране. С SJ связаны белки-супрессоры опухолей: летальные гигантские личинки (Lgl), большие диски (Dlg), Scribble (Scrib) и фасциклин III (Bilder et al., 2000; Билдер и др., 2003; Таненцапф и Тепасс, 2003). Базальная мембрана характеризуется локализацией рецепторов внеклеточного матрикса, а именно интегринов и дистрогликана (Dg) (Tanentzapf et al., 2000; Schneider et al., 2006; Denef et al., 2008). Десятилетия исследований показали, что эти различные регуляторные белковые комплексы взаимодействуют в сложной, но в высшей степени консервативной петле обратной связи для установления и поддержания эпителиальной полярности (Bilder et al. , 2003; St Johnston and Ahringer, 2010; Laprise and Tepass, 2011; Rodriguez- Булан и Макара, 2014 г.).

Эпителий Drosophila можно разделить на первичный эпителий, который происходит из эмбрионального эпителия бластодермы, и вторичный эпителий, который образуется в результате мезенхимально-эпителиальных переходов (Tepass et al., 2001). Формирование эпителия у эмбриона дрозофилы происходит посредством модифицированной формы цитокинеза, называемой «целлюляризация». После оплодотворения эмбрион дрозофилы претерпевает 13 раундов ядерных делений без цитокинеза, чтобы сформировать синцитий, состоящий примерно из 6000 ядер.Большинство этих ядер выравниваются непосредственно под эмбриональной поверхностью, где они окружаются инвагинациями плазматической мембраны, образуя однородный высокополяризованный эпителий (Tepass et al., 2001; Harris, 2012; Choi et al., 2013). Несколько исследований показали, что Baz играет ключевую роль в установлении и поддержании апико-базальной полярности во время целлюляризации (Bilder et al. , 2003; Harris and Peifer, 2004; Harris, 2012; Choi et al., 2013). В начале целлюляризации локализация Baz на апикальной окружности опосредуется Dynein и взаимно зависит от актин-соединяющего линкера, Cno.Во время целлюляризации локализация и формирование AJs, а также апикальная локализация aPKC, Par6 (Harris and Peifer, 2005; Harris and Peifer, 2007) и Crb (Bilder et al., 2003) требуют функции Baz. Baz также важен для развития зиготического эпителия, т.к. в его отсутствие нейроэктодермальные клетки теряют апико-базальную полярность, что приводит к образованию больших отверстий в вентральном эпидермисе (Harris and Tepass, 2008).

Хотя процессы, идентичные целлюляризации, не были описаны у млекопитающих, существует некоторое сходство между поляризацией клеток млекопитающих и вторичным эпителием у Drosophila (Goldstein and Macara, 2007; St Johnston and Ahringer, 2010; Tepass, 2012; Rodriguez-Boulan). и Макара, 2014 г.).Фолликулярный эпителий (FE) Drosophila является прекрасным примером вторичного эпителия. Соматические стволовые клетки, присутствующие в гермарии яичника, делятся асимметрично с образованием мезенхимальных предшественников, которые генерируют клетки FE посредством мезенхимально-эпителиального перехода (Margolis and Spradling, 1995; Wu et al., 2008). В отличие от клеточного эмбриона, который полагается исключительно на апикальные сигналы для своей поляризации, поляризация клеток FE зависит от апикальных, латеральных и базальных сигналов (Tanentzapf et al., 2000).

Несмотря на фенотипические различия между развивающимся FE и целлюляризирующимся эмбрионом, углубленные исследования выявили резкое сходство в лежащих в основе молекулярных механизмах и белковых взаимодействиях, регулирующих поляризацию обеих тканей (Tanentzapf et al., 2000; Franz and Riechmann, 2010). ; Morais-de-Sá et al. , 2010; Rodriguez-Boulan and Macara, 2014). Как и у целлюлярного эмбриона, Baz играет ключевую роль в поляризации FE клеток (Franz and Riechmann, 2010).На ранних стадиях поляризации Baz локализуется как в AJs, так и в апикальной мембране (Morais-de-Sá et al., 2010). В AJs он связывается с Arm и Ed (Wei et al., 2005) и необходим для их правильного позиционирования (Franz and Riechmann, 2010; Morais-de-Sá et al., 2010). В отсутствие Arm Baz продолжает локализоваться в коре, но эктопически распространяется в базолатеральный домен и распределяется глыбами вдоль апикальной мембраны, в противоположность формированию однородного пояса (Franz and Riechmann, 2010).Т.о., компоненты Baz и AJ взаимно зависят друг от друга в отношении позиционирования в соответствующих им мембранных доменах.

Помимо этих взаимодействий, Baz также связывается с Sdt, aPKC и Par6 и рекрутирует их вместе с Crb в апикальный домен по мере развития (Franz and Riechmann, 2010; Krahn et al. , 2010b; Morais-de-Sá et al. ., 2010). Клональный анализ показывает, что на ранней и поздней стадии baz мутантные клоны FE, aPKC, Par6, Crb и Sdt не локализуются в коре головного мозга (Franz and Riechmann, 2010; Morais-de-Sá et al., 2010). С др. стороны, в то время как апикальная локализация Baz теряется на ранней стадии crb , aPKC и par6 мутантных клонов, пул AJ остается незатронутым (Morais-de-Sá et al., 2010). Т.о., согласно современной модели установления апико-базальной полярности в FE, Baz функционирует на вершине генетической иерархии в спецификации эпителиальной апикальной мембраны (Franz and Riechmann, 2010).

По мере созревания эпителия апикальная локализация Baz постепенно утрачивается, а оставшийся белок локализуется преимущественно в AJ, в то время как aPKC, Par6, Sdt и Crb совместно локализуются в SAR (Morais-de-Sá et al., 2010). Недавние исследования показали, что исключение Baz из SAR является ключевым шагом в установлении и поддержании апикальной мембраны. Связывание Baz с aPKC и Sdt ингибируется фосфорилированием Baz с помощью aPKC по Ser-980, в то время как Crb вытесняет Baz за связывание с Par6 (Morais-de-Sá et al., 2010; Walther and Pichaud, 2010; Krahn et al. ., 2010b; Laprise and Tepass, 2011). Эти динамичные и многогранные взаимодействия функционируют вместе, чтобы облегчить перемещение Baz из SAR и способствовать его локализации в ZA (Harris and Peifer, 2005; McGill et al., 2009; Кран и др., 2010b; Мораис-де-Са и др., 2010 г.; Вальтер и Пишо, 2010 г.; Лаприз и Тепасс, 2011). Существенное требование для исключения Baz из SAR отражается в серьезных дефектах полярности, вызванных экспрессией версии Baz, которая не может фосфорилироваться по Ser-980 и, таким образом, остается связанной с aPKC и Sdt. Клетки FE, экспрессирующие такую ​​мутированную версию Baz, демонстрируют постоянную апикальную колокализацию Baz с aPKC, Par6, Crb и Sdt, а также релокализацию белков AJ на апикальную мембрану (Krahn et al., 2010б; Морайс-де-Са и др., 2010).

Помимо своей важной роли в установлении и поддержании апико-базальной полярности в эпителиальных клетках Drosophila , Baz играет ключевую роль в различных других типах клеток. Он необходим для поляризации развивающихся ооцитов и поддержания клеточной судьбы ооцитов (Huynh et al., 2001; Pinal et al., 2006; Becalska and Gavis, 2010). В нейробластах он функционирует в комплексе с aPKC, Par6 и Inscuteable (Insc), способствуя асимметричному клеточному делению посредством установления полярности коры и регуляции ориентации веретена (Wodarz et al., 1999; Шобер и др., 1999; Водарз и др., 2000; Петронски и Кноблих, 2001; Роллс и др., 2003; Этвуд и др., 2007 г.; Хартенштейн и Водарц, 2013).

Большинство исследований, изучающих функцию Baz в развитии Drosophila , в том числе характеризующие его функцию в процессе целлюляризации (Müller, Wieschaus, 1996; Bilder et al. , 2003; Tanentzapf, Tepass, 2003; развития (Müller and Wieschaus, 1996; Bilder et al., 2003; Таненцапф и Тепасс, 2003 г.; Harris and Tepass, 2008), эмбриональные нейробласты (Schober et al., 1999; Wodarz et al., 1999; Atwood et al., 2007), полярность ооцитов (Cox et al., 2001; Huynh et al., 2001; Doerflinger et al., 2010; Becalska and Gavis, 2010) и разработка КЭ (Abdelilah-Seyfried et al., 2003; Franz and Riechmann, 2010; Morais-de-Sá et al., 2010) проводились с использованием baz ^{. 4} (также известный как baz ^xi106 ) и аллели baz ^815-8 .Эти аллели считались нулевыми аллелями, поскольку они содержат стоп-кодоны, вызывающие делецию более двух третей белка Baz (Krahn et al., 2010a).

В этом исследовании мы переоцениваем функцию Baz в различных контекстах развития, используя два ранее сгенерированных, но фенотипически не охарактеризованных аллеля, baz ^EH747 и baz ^XR11 . Эти два аллеля являются добросовестными нулевыми аллелями, которые не дают какого-либо обнаруживаемого белка Baz.Мы обнаружили, что все аллели baz обнаруживают сходные дефекты во всех оцененных контекстах развития, за исключением FE. Здесь BAZ ^EH747 и и BAZ ^XR11 FE клоны дисплея нормальная апико-базальная полярность в отличие от BAZ ⁴ и BAZ ^815-8 клонов, которые часто теряют полярность и вызывают пробелы в эпителий. Наши данные показывают, что хромосомы baz ⁴ и baz ^815-8 могут нести дополнительные мутации, которые сильно усиливают нулевой фенотип baz .В отличие от предыдущих сообщений, мы показываем, что Baz не требуется для правильного позиционирования AJ или апикальной локализации aPKC, Par6, Sdt или Crb в FE. Кроме того, образование апикального домена плазматической мембраны также обычно происходит в его отсутствие. Скрининг генетического взаимодействия показывает, что фенотип нулевого FE baz сильно усиливается за счет снижения уровней Crb.

BAZ ^EH747 и и BAZ ^{и XR11} Fe Clones Show Высокотехнология сзади вспомогательная фолликулярная клетка (PFC), но тяжесть многослойных клеток намного мягче, чем в клонах для BAZ ⁴ и BAZ ^{815 -8} .Многослойность PFC обычно наблюдается у мутантов, влияющих на передачу сигналов Hippo и Notch, что указывает на потенциальное участие Baz в этих сигнальных путях.

В целом, наши результаты указывают на вспомогательную роль Baz в поляризации клеток FE и бросают вызов текущей модели, которая ставит его на вершину генетической иерархии в этом процессе.

Следующие мутантные аллели были использованы в этом исследовании: BAZ ⁴ FRT19A (подарок от Chris Doe), BAZ ^EH747 FRT19A (Eberl and Hilliker, 1988), BAZ ^XR11 FRT19A (Ralf Stanewsky , неопубликовано), baz ^815–8 FRT19A (McKim et al. , 1996), APKC ^K06403 FRT42B (Wodarz et al., 2000; Rolls et al., 2003), CRB ^11A22 FRT82B (Tepass and Unust, 1993), LGL ⁴ (Hanratty , 1984), PAR1 ^W3 FRT42B (Shulman et al., 2000), Scrib ^{2 SCRIB 2 FRT82B (Bilder et al., 2003), PP2A GE16781 (Genexel) (Krahn et al. , 2009), PTEN dj189 (Gao et al., 2000), shg R69 FRT42B (Godt and Tepass, 1998), FRT19A, Ubi-GFP FRT19A; e22c-gal4 UAS-Flp, e22c-gal4 UAS-Flp; FRT82B UBI-GFP (подарок от Trudi Schuppach), PAR6 Δ226 FRT19A и CDC42 и CDC42 4 FRT19A (Jones and Metzstein, 2011), ED 1×5 FRT40A (Wei et al., 2005), cno R2 FRT82B (Sawyer et al., 2009), UAS-баз-GFP , UAS-баз-Δ312-1464-GFP , UAS-баз1-ΔGFP (Бентон и Сент-Джонстон, 2003 г. ), FRT19A tubP-Gal80LL1 hsFLP; tubP-gal4 UAS-mCD8-GFP (подарок Heinrich Reichert), yki-RNAi v104523 (Венский ресурсный центр по дрозофилам), baz-GFP-trap CC01941 (Buszczak et al., 2007), tj-GAL4 (Хаяши и др., 2002). Следующие акции были получены из Bloomington Stock Center: hsFlp 122 FRT19A h3AvD-GFP (#32045), FRT19A (#1709), FRT19A ovoD (#0f-ovop ##230006), 8705), GFP-РНКи (#41556).Для этого исследования были сгенерированы следующие строки: baz EH747 FRT19A;; UAS-baz-GFP , baz EH747 FRT19A; ;УАС-баз-Δ312-1464-GFP , и баз 4 FRT19A;;УАС-баз-GFP .}

Фиксированные яичники или головной мозг блокировали в 5% нормальной лошадиной сыворотке (NHS)/1% Triton X-100/PBS на 30 мин.Заблокированные яичники и головной мозг промывали 3 раза в PBS для удаления избытка Triton X-100, а затем инкубировали в течение ночи при 4°C в 5% NHS/PBT с первичными антителами. Эмбрионы блокировали в 5% NHS/PBT в течение 30 мин, а затем инкубировали в течение ночи при 4°C в 5% NHS/PBT с первичными антителами. Образцы промывали 3 раза по 20 мин в PBT при комнатной температуре. Затем образцы блокировали 5% NHS/PBT в течение 30 минут и инкубировали со вторичными антителами и DAPI в 5% NHS/PBT при 1:500 в течение 2 часов при комнатной температуре.Затем раствор вторичного антитела удаляли, а образцы промывали 3 раза в течение 20  мин ФБТ. Образцы, окрашенные флуоресцентно-конъюгированными вторичными антителами, помещали в Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) или Mowiol. Конфокальную микроскопию проводили на конфокальном микроскопе Zeiss LSM510 Meta. Изображения были обработаны в Photoshop CS3 (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния, США) и собраны с использованием Illustrator CS3 (Adobe, Сан-Хосе, Калифорния, США). В качестве первичных антител использовались кроличьи анти-Baz N-term (1:1000, Wodarz et al., 1999), анти-Baz PDZ морской свинки (1:1000), анти-Par6 крысы (1:500), анти-Mira морской свинки (1:1000, Kim et al. , 2009), анти-Lgl морской свинки ( 1:500), крысиный анти-Crb (1:500, подарок У. Тепасса), мышиный анти-Sdt (1:25, подарок Э. Кнуста), кроличий анти-Cno (1:500, подарок М. Pfeifer), кроличьи анти-lacZ (1:1000, MP Biosciences), кроличьи анти-aPKC (1:500, Santa Cruz Biotechnology), мышиные анти-GFP A11120 (1:1000, Molecular Probes), кроличьи анти-GFP A11122 ( 1:1000, молекулярные зонды). Следующие антитела были получены из Банка гибридомных исследований развития: крысиные анти-DE-кадгерин DCAD2 (1:500), мышиные анти-Dlg 4F3 (1:25), мышиные анти-Orb 4H8 (1:20) и мышиные анти- Броненосец N2 7A1 (1:50).

Учитывая, что оба baz ^EH747 и baz ⁴ демонстрируют различные фенотипы в FE, мы затем рассмотрели, демонстрируют ли эти аллели разные фенотипы в других тканеспецифических контекстах. Мы сравнили фенотипы целлюляризации, проявляемые материнскими зиготными эмбрионами baz ⁴ и baz ^EH747 . Предыдущие исследования с использованием аллеля baz ⁴ показали, что baz является эпистатическим по отношению к другим членам комплекса Par и комплекса Crb во время целлюляризации (Bilder et al., 2003; Харрис и Пайфер, 2004). Наш анализ показал, что материнские зиготические мутанты baz ⁴ и baz ^EH747 демонстрируют сходные фенотипы во время целлюляризации, при этом aPKC и DE-cad не могут локализоваться в своих нормальных положениях (дополнительный материал, рис. S4).

Ген baz первоначально был идентифицирован по его сильному эмбриональному фенотипу, характеризующемуся образованием больших отверстий в вентральном эпидермисе (Wieschaus et al., 1984; Мюллер и Вишаус, 1996 г.; Билдер и др., 2003; Харрис и Тепасс, 2008 г.). Наше сравнение развития зиготического эпителия у baz ⁴ и baz ^EH747 зиготических мутантных эмбрионов с помощью анализа иммуноокрашивания выявило неразличимые фенотипы, характеризующиеся большими отверстиями в вентральном эпидермисе на стадии 13 эмбрионов обоих генотипов (s). ).

Было также показано, что

Baz участвует в развитии ооцитов, где требуется, чтобы ооцит сохранял свою ДНК в гаплоидной кариосоме, по сравнению с 15 полиплоидными питательными клетками, с которыми он делит яйцеклетку (Cox et al., 2001; Huynh и др., 2001). Более того, ооцит не может обогащать белком Orb после стадии 3 в отсутствие Baz. Наше сравнение BAZ ⁴ и BAZ ^EH747 EH747 EH747 ALLELELES В этом контексте развития выявлены одинаковые дефекты при разработке Ооцита с BAZ ^{4 и BAZ EH747 Мутантные ядра OOCYTE, становятся полиплеидами и неудачей для поддержания обогащения сферы после этапа 3 (дополнительный материал, рис.С6).}

Наконец, мы попытались сравнить фенотипы аллелей baz ⁴ и baz ^EH747 в митотических нейробластах. Мы попытались сгенерировать и сравнить BAZ ^{4 BAZ и BAZ EH747 Mutant Neuroblasts в конце ступени 3-й инстанты личинки мозги с использованием техники MARCM, но не смогли идентифицировать BAZ 4 или BAZ EH747 GFP пометил личиночные мутантные нейробласты по сравнению с контролем FRT19A (дополнительный материал, таблица S1).Тем не менее, GFP, заметные нейронные предшественники регулярно идентифицировали в BAZ 4 и BAZ EH747 мозаики мозаики, поднятие возможности, что и BAZ 4 и BAZ EH747 мутантные нейробласты не могут поддерживать судьбу стволовых клеток или подвергаться апоптозу.}

В целом, результаты этих экспериментов показывают, что, хотя фенотипы для baz ⁴ и baz ^EH747 аллелей резко различаются в FE, нет никаких расхождений в клеточных эмбрионах, эмбриональном эпителии, ооцитах или нейробластах.

Предыдущие исследования с использованием аллелей baz ⁴ и baz ^815-8 показали, что baz необходим для поляризации ДЭ. Клоны baz ⁴ и baz ^815-8 демонстрируют большие отверстия в КЭ и сильную многослойность ПФУ. Считалось, что baz функционирует на вершине генетической иерархии, определяя апикальную мембрану, поскольку ни Par6, aPKC, Crb, ни Sdt не обнаруживают апикальной локализации в мутантных клонах baz ⁴ и baz ^815-8 . , тогда как корковая локализация Baz сохраняется в мутантных клонах par6 , aPKC , crb и sdt (Franz and Riechmann, 2010; Morais-de-Sá et al., 2010). Напротив, наши результаты анализа аллелей baz ^EH747 и baz ^XR11 свидетельствуют о том, что baz не играет существенной роли в поляризации ДЭ, так как дефекты, наблюдаемые в baz EH74 и baz ^XR11 клоны FE были статистически незначимыми по сравнению с контрольными клонами FRT19A . Кроме того, локализация aPKC, Crb, Par6 и Sdt не изменилась в клонах baz ^EH747 FE.После наблюдения этого несоответствия в фенотипах мы попытались ответить на два важных и взаимосвязанных вопроса. Во-первых, какой из этих аллелей представляет истинный фенотип потери функции baz , а во-вторых, какова основная причина различий, наблюдаемых между этими аллелями.

Наш анализ иммунного окрашивания показал, что белок Baz отсутствовал в клонах FE для всех исследованных аллелей baz .Эти данные иммунного окрашивания были дополнительно подтверждены нашим вестерн-блот-анализом, который выявил отсутствие белка Baz в baz ^EH747 и baz ^XR11 и присутствие укороченных белков Baz в baz ⁴

94

7.

^815-8 белковые экстракты. И мягкий многослойный фенотип из BAZ ^EH747 и и BAZ ^XR11 аллелей, а также сильный многослойный фенотип и Fehs BAZ 4 BAZ ⁴ и BAZ ^815-8 ALLELES могут быть спасены сверхэкспрессией UAS-Baz-GFP , что указывает на то, что потеря полноразмерного Baz лежит в основе как сильного, так и слабого фенотипа FE. На основании этих результатов можно предположить, что линии baz ⁴ и baz ^815-8 несут энхансерные мутации или функционируют как неоморфные аллели за счет экспрессии укороченных фрагментов белка Baz. В качестве альтернативы линии baz ^XR11 и baz ^EH747 могут нести дополнительные супрессорные мутации. Однако фенотип, генерируемый GFP-RNAi , направленный против baz-GFP Trap , который возникает в отсутствие укороченных фрагментов белка Baz или каких-либо потенциальных энхансерных или супрессорных мутаций, присутствующих в вышеупомянутых линиях, сильно напоминает baz ^EH747. и baz ^XR11 фенотип.Таким образом, эти данные свидетельствуют в пользу того, что baz ^XR11 и baz ^EH747 представляют собой истинный baz фенотип потери функции при FE.

Затем мы попытались определить, связана ли основная причина тяжелого фенотипа, проявляемого аллелями baz ⁴ и baz ^815-8 , с образованием укороченных фрагментов белка Baz, которые нарушают полярность, или присутствием дополнительных энхансерных мутаций в этих линиях. Экспрессия N-концевого фрагмента Baz в мутантном фоне baz ^EH747 не усиливала фенотип легкой потери функции baz , указывая на то, что baz ⁴ и baz 9007 9007 9129-8 вряд ли являются неоморфными аллелями. С другой стороны, удаление одной копии Crb или APKC из млн клонов BAZ ^{EH747 EH747} EH747 Fe Clones привели к серьезным дефектам, что Фенокопия BAZ ⁴ и BAZ ^815-8 Fe клонов.Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что штаммы, несущие аллели baz ⁴ и baz ^815-8 , содержат дополнительные мутации, усиливающие истинный baz фенотип потери функции. Поскольку аллели baz ⁴ и baz ^815-8 были получены с помощью EMS и рентгеновского мутагенеза соответственно, представляется вероятным, что соответствующие хромосомы накапливали дополнительные мутации. Однако, учитывая, что дефекты FE, наблюдаемые в клонах baz ⁴ , могут быть полностью устранены путем экспрессии полноразмерного Baz (дополнительный материал, рис.С1; Бентон и Сент-Джонстон, 2003 г.; Morais-de-Sá et al., 2010), высокая пенетрантность фенотипа FEH и тяжелая многослойность PFC, вероятно, являются результатом синергетического усиления мутантного фенотипа baz дополнительными мутациями, которые не приводят к дефектам FE. самостоятельно. Учитывая, что sdt и par6 , два известных интерактора baz , также расположены на первой хромосоме, можно предположить, что гипоморфные мутации в любом из этих генов могут привести к сильной пенетрантности фенотипов FE, наблюдаемой у baz ⁴ и баз ^815-8 клонов.

Подавляющее большинство клонов baz ^EH747 и baz ^XR11 FE показали нормальную поляризацию FE и сохранили локализацию aPKC, Par6, Crb и Sdt. С др. стороны, мутантные эмбрионы baz ^EH747 m/z неспособны установить апико-базальную полярность во время целлюляризации, что отражается в их неспособности локализовать DE-cad и aPKC в соответствующих местах.Из этих результатов можно сделать вывод, что baz играет существенную роль в установлении и поддержании полярности во время целлюляризации, но не в ФЭ. Это поднимает важный вопрос о том, почему требования к функции baz различаются в этих двух контекстах развития.

Одним из объяснений этого несоответствия может быть то, что Baz функционирует избыточно с др. белком в установлении и поддержании апико-базальной полярности в FE по сравнению с эмбрионом.Несколько линий доказательств указывают на то, что crb , который также демонстрирует серьезные дефекты апико-базальной полярности у эмбриона, но легкие дефекты FE, может функционировать избыточно с baz в определенных контекстах развития (Morais-de-Sá et al. al., 2010; Walther and Pichaud, 2010; Fletcher et al., 2012; Thompson et al., 2013). Напр., во время развития FE Baz первоначально апикально колокализуется с aPKC и Par6, но постепенно замещается Crb и ограничивается базально AJs (Franz and Riechmann, 2010), что указывает на то, что Crb может функционировать избыточно с Baz при поддержании полярности.Наши эксперименты показали, что фенотип baz ^EH747 FE сильно усиливается за счет потери одной копии crb , тогда как в предыдущем отчете Morais-de-Sá et al., 2010 (Morais-de-Sá et al. ., 2010) показали, что сверхэкспрессия Baz может восстанавливать crb мутантных дефектов FE. Эти данные, взятые вместе, могут привести к предположению, что Crb и Baz могут замещать друг друга в установлении и поддержании апико-базальной полярности в FE. Однако экспрессия Crb и локализация на апикальной мембране клеток FE происходит на стадии 1, через некоторое время после того, как Baz, aPKC и Par6 обнаруживаются в области 2B гермария (Franz and Riechmann, 2010). Таким образом, Crb вряд ли заменит Baz в установлении полярности в ДЭ.

Другое возможное объяснение расходящихся требований к baz в установлении эпителиальной полярности во время целлюляризации по сравнению с развитием FE — это различие в основных сигналах полярности, действующих в этих тканях. Как упоминалось ранее, клетки FE происходят из соматических стволовых клеток в нише яичников и используют базальные, латеральные и апикальные сигналы для установления полярности, когда они подвергаются мезенхимально-эпителиальному переходу.Напр., контакта между поляризующими предшественниками FE и нижележащей базальной мембраной достаточно для спецификации базальной мембраны, в то время как зародышевые клетки действуют как сигнал для поляризации и спецификации апикальной и латеральной мембран (Tanentzapf et al., 2000). С другой стороны, единственный сигнал поляризации, идентифицированный во время целлюляризации, — это эмбриональная мембрана, которая продолжает формировать апикальную мембрану после завершения целлюляризации (Mavrakis et al. , 2009; Choi et al., 2013). Таким образом, можно предположить, что наличие сигналов множественной полярности в FE достаточно, чтобы компенсировать отсутствие baz во время установления полярности. Это объяснение далее подтверждается нашими находками, что Cno, который важен для установления апико-базальной полярности у клеточных эмбрионов, проявляет только умеренные дефекты полярности в FE, сходные с baz . Таким образом, можно предположить, что функция Baz в установлении полярности FE может дублировать другие сигналы базальной, латеральной и апикальной полярности, в то время как его функция в поддержании апико-базальной полярности может дублировать Crb.

.