Содержание

Форма П-1 (СХ). Сведения о производстве и отгрузке сельскохозяйственной продукции | Образец — бланк — форма

Форма П-1 (СХ) Сведения о производстве и отгрузке сельскохозяйственной продукции сдают в территориальный орган Росстата все юридические лица всех форм собственности, осуществляющие сельскохозяйственную деятельность (в соответствии с Общероссийским классификатором видов экономической деятельности (ОКВЭД) коды 01.1, 01.2, 01.3, 01.4), кроме субъектов малого предпринимательства и крестьянских (фермерских) хозяйств. Статистический отчет необходимо предоставлять с месячной периодичностью.

Форма П-1 (СХ) утверждена Приказом Росстата от 17.09.2010 N 319.

При наличии у юридического лица обособленных подразделений форма федерального статистического наблюдения заполняется как по каждому обособленному подразделению, так и по юридическому лицу без этих обособленных подразделений.
Руководитель юридического лица может назначать должностных лиц, уполномоченных предоставлять статистическую информацию от имени юридического лица.

Заполненные формы предоставляются юридическим лицом в территориальные органы Росстата по месту нахождения соответствующего обособленного подразделения (по обособленному подразделению) и по месту нахождения юридического лица (без обособленных подразделений). В случае, когда юридическое лицо (его обособленное подразделение) не осуществляет деятельность по месту своего нахождения, форма предоставляется по месту фактического осуществления им деятельности.

В адресной части формы указывается полное наименование отчитывающейся организации в соответствии с учредительными документами, зарегистрированными в установленном порядке, а затем в скобках — краткое наименование. На бланке формы, содержащей сведения по обособленному подразделению юридического лица, указывается наименование обособленного подразделения и юридического лица, к которому оно относится.

По строке «Почтовый адрес» указывается наименование субъекта Российской Федерации, юридический адрес с почтовым индексом; если фактический адрес не совпадает с юридическим, то указывается также фактический почтовый адрес.

Для обособленных подразделений, не имеющих юридического адреса, указывается почтовый адрес с почтовым индексом.

Юридическое лицо проставляет в кодовой части формы код Общероссийского классификатора предприятий и организаций (ОКПО) на основании Уведомления о присвоении кода ОКПО, направляемого (выдаваемого) организациям территориальными органами Росстата.

По территориально обособленным подразделениям юридического лица указывается идентификационный номер, который устанавливается территориальным органом Росстата по месту расположения территориально обособленного подразделения.

В случаях использования земельных участков, скота и птицы на правах аренды арендатор предоставляет статистический отчет о производстве и отгрузке сельскохозяйственной продукции в территориальный орган государственной статистики по месту расположения земель, скота и птицы.

При реорганизации или ликвидации юридического лица статистическая информация по форме N П-1(СХ) предоставляется за период деятельности в отчетном периоде до момента ликвидации (реорганизации).

Временно неработающие организации, которые в течение части отчетного периода осуществляли сельскохозяйственную деятельность, форму федерального статистического наблюдения предоставляют на общих основаниях с указанием, с какого времени они не работают.

В случае изменения структуры юридического лица в отчетном году в форме федерального статистического наблюдения данные за отчетный период текущего года приводятся исходя из новой структуры юридического лица.

Все показатели в форме заполняются в целых числах без десятичного знака.

Форма федерального статистического наблюдения N П-1(СХ) служит только для получения сводной статистической информации и не может быть предоставлена иным лицам.

Форма 1-СХ-цены: что это такое?

Сельское хозяйство важно для экономики страны, так как благодаря этой отрасли граждане обеспечены продуктами питания. На развитие сельхозсектора правительство выделяет большие деньги, поэтому Росстат регулярно отслеживает занятость предприятий сельским хозяйством при помощи отчетов по затратам на этот вид бизнеса.

Для чего нужен отчет по форме 1-СХ-цены

Федеральная служба статистики контролирует регулирование ценовой политики в с/х отрасли, принимая отчеты по форме 1-СХ-цены от фирм-производителей. Бланк выглядит как анкета, которая состоит из титульного листа и таблицы, отражающей произведенные и реализованные позиции, а также их стоимость с учетом изменений. Согласно Приказу Росстата № 509 от 01.08.2017, все юридические лица и предприниматели, занятые в сельскохозяйственном секторе, сдают статистическую отчетность, заполняя бланк для предъявления федеральной госслужбе статистики. Исключение составляют фермерские хозяйства, а также микропредприятия.

Содержание заполненной анкеты позволяет государству определить, как расходуются субсидии, затраченные на развитие, кредитование, финансирование научных исследований в с/х отрасли. Также Росстат выявляет среднюю плату за продукцию, а также индекс стоимости продуктов питания, чтобы определить уровень благосостояния страны и граждан.

Сведения о ценах производителей сельскохозяйственной продукции обуславливают рентабельность экспорта и импорта продовольствия с соседними государствами, включая страны бывшего СНГ.

Отчетность лиц, занятых производством сельхозпродукции, отражает независимость страны от «соседей». Поэтому отчет по форме 1-СХ-цены, утвержденный Приказом Росстата, важен для оценки экономической ситуации в государстве.

Изменения формы 1-СХ-цены в 2018 году

2018 год не стал временем изменений для бланка 1-СХ, но 16 июля текущего года планируют внести изменения в анкету. Законопроект уже издан, но Приказ не вступил в силу и редакция проекта недоступна. На данный момент содержание бланка, требования к сдаче и заполнению остались прежними:

● отчитываются юридические лица и предприятия, занятые сельским хозяйством, за исключением КФХ и микроорганизаций;

● сдают отчет 20-го числа каждого месяца, так как 1-СХ-цены — вид ежемесячной отчетности;

● наказание за непредставление или несвоевременную подачу соответствует нормам ст. 13.19 КоАП РФ;

● формат электронного файла .xml сохраняет конфиденциальность документации, которая должна соответствовать заполненному бланку со сведениями о ценах производителей сельскохозяйственной продукции;

● для облегчения работы сотрудникам организации, которые составляют отчет, предоставляют бесплатное программное обеспечение.

Росстат по-прежнему строго проверяет достоверность информации, а также правильности оформления отчета.

14 новых форм статотчетности для сельскохозяйственных и природоохранных организаций

Росстат приказом от 26.08.2021 № 561 ввел 14 форм отчетности для фермеров, организаций сферы природопользования и сельского хозяйства.

С отчета за 2021 года нужно применять следующие годовые формы:

— № 4-ОС «Сведения о текущих затратах на охрану окружающей среды»;

— № 1-ООПТ «Сведения об особо охраняемых природных территориях»;

— № 2-ТП (охота) «Сведения об охоте и охотничьем хозяйстве»;

— № 1-ЛХ «Сведения о воспроизводстве лесов и лесоразведении» ;

— № 12-ЛХ «Сведения о защите лесов»;

— № 9-СХ «Сведения о внесении удобрений и проведении работ по химической мелиорации земель»;

— приложение к форме № 21-СХ «Сведения о вывозе сельскохозяйственной продукции»;

— № 4-кооператив «Сведения о деятельности сельскохозяйственных потребительских кооперативов (за исключением перерабатывающих, снабженческо-сбытовых и кредитных)»;

— № 10-МЕХ (краткая) «Сведения о наличии тракторов, сельскохозяйственных машин и энергетических мощностей».

А с отчета за 2022 год нужно применять новые ежемесячные и ежеквартальные формы:

— № П-1 (СХ) «Сведения о производстве и отгрузке сельскохозяйственной продукции»;

— № 2-фермер «Сведения о сборе урожая сельскохозяйственных культур»;

— № 2 «Сведения о производстве сельскохозяйственной продукции в личных подсобных и других индивидуальных хозяйствах граждан»;

— № 1-СХ (баланс)-срочная «Сведения о движении зерна и продуктов его переработки»;

— № 21-СХ «Сведения о реализации сельскохозяйственной продукции».

Также приказ содержит новые правила заполнения уже существующей формы № 2 «Сведения о производстве сельскохозяйственной продукции в личных подсобных и других индивидуальных хозяйствах граждан».

Одновременно упраздняются действовавшие ранее аналогичные формы отчетов.

Сдать отчетность можно легко через сервисы Такском. Мы предлагаем несколько решений для электронной отчетности на выбор:

— Программа, устанавливаемая на ПК;

— Веб-решение, работающее через браузер;

— Решение для программ семейства 1С.

Почему сдавать отчеты в Росстат удобно через сервисы Такском:

— Понятный интерфейс;

— Создание отчетов с использованием готовых шаблонов;

— Только актуальные на сегодняшний день формы отчетов;

— Текстовые подсказки по заполнению форм;

— Система проверки форм отчетов на ошибки;

— Бухгалтерский календарь со сроками сдачи отчетов.

Подобрать тарифный план на отчетность может организация на любом налоговом режиме. Новые направления обмена — например, с ФСС, Центробанком и т.д., — подключаются опционально.

Для консультации от наших специалистов оставьте свой номер в заявке на сайте — мы перезвоним вам и ответим на все вопросы, а также поможем в выборе решения и тарифа.

Отправить

Запинить

Твитнуть

Поделиться

Поделиться

Продольное расположение двигателя и премиальное позиционирование. Представлена Mazda CX-60

8 марта Mazda представила очередную новинку – среднеразмерный кроссовер CX-60. Важный момент: это не замена одной из прежних моделей, а расширение продуктовой линейки бренда.

Drom.ru объясняет, чем «шестидесятка» принципиально отличается от других кроссоверов Mazda. Во-первых, в ее основе лежит новое шасси Skyactiv Multi Solution Scalable Architecture (SMSSA) с классической компоновкой, то есть продольным расположением двигателя и задними ведущими колесами. Остальные кроссоверы бренда опираются на недорогие платформы с поперечным размещением мотора и основным передним приводом. Во-вторых, с чисто имиджевой точки зрения CX-60 встанет на ступень выше прочих автомобилей Mazda и будет позиционироваться как продукт премиум-класса.

Длина, ширина, высота новинки составляют 4745, 1890 и 1670 мм соответственно, колесная база – 2870 мм. Экстерьер CX-60 излучает спортивный характер, который задается выразительными пропорциями кузова: длинным капотом, смещенной назад кабиной и коротким передним свесом. Также привлекают внимание замысловатая пластика боковин и брутальное оформление носовой части с огромной по площади решеткой радиатора и нарочито небольшими блок-фарами.

Издание пишет, что линейка CX-60 будет включать три моторные модификации, но пока раскрыли технические характеристики только одной из них – подзаряжаемого гибрида PHEV. В составе силовой установки суммарной отдачей 327 л.с. и 500 Нм – 2,5-литровый атмосферный бензиновый мотор (189 л.с. и 261 Нм), электродвигатель (136 л.с. и 250 Нм), 8-ступенчатая АКПП и тяговая литий-ионная батарея емкостью 17,8 кВт*ч.

С 0 до 100 км/ч CX-60 PHEV разгоняется за 5,8 секунды, максимальная скорость ограничена на уровне 200 км/ч в обычном режиме и на 140 км/ч при езде на чистой электротяге. Средний расход бензина CX-60 PHEV составляет лишь 1,5 л / 100 км, с отключенным ДВС и на полном заряде батареи машина может проехать до 63 км. Привод полный. Кроссовер весит 2055-2070 кг в зависимости от комплектации, причем это сухой вес, то есть без учета водителя и с пустым бензобаком. Батарею можно подзаряжать от станции мощностью до 7,8 кВт.

Позже появятся бензиновый и дизельный варианты. Первый будет иметь 3,0-литровый рядный 6-цилиндровый мотор семейства Skyactiv-X, второй – 3,3-литровый Skyactiv-D. В обоих случаях помимо ДВС станет использоваться 48-вольтовый стартер-генератор, который помогает снижать расход топлива и объемы выбросов.

В салоне новинки – пять мест, горизонтальная архитектура передней панели, цифровой щиток приборов и экран мультимедиа планшетного типа. Диагонали обоих экранов – 12,3 дюйма.

В США и Канаде уже есть более простой кроссовер СХ-50 с поперечным расположением двигателя и базовым передним приводом, потому новинка предназначена для рынков Японии и Европы. Для последней уже и цены озвучены: от 52.000 до 70.000 евро. Продажи стартуют в 2023 году.

Системное руководство по Nikon 1 (CX) | Без зеркала

Элементы в одной строке указывают на обновления модели. Разные линии обозначают разные уровни модели.

Примечание. Компания Nikon прекратила выпуск системы CX в 2018 г. Завод, производивший эти продукты, был закрыт. Никаких новых продуктов Nikon 1 не появится.

Компания Nikon удивила мир в 2011 году, представив Nikon 1, поставив две модели камер, несколько объективов и новую линейку аксессуаров.В основном сюрпризов было два: (1) использование небольшого 1-дюймового сенсора в беззеркальной системе Nikon; и (2) невероятная производительность автофокуса, которой Nikon добился в этих беззеркальных моделях.

Эта производительность фокусировки была непревзойденной для любой беззеркальной камеры того времени и была близка к уровню зеркальных камер. Даже сегодня система автофокусировки Nikon 1 по-прежнему находится на вершине рейтинга среди беззеркальных камер, несмотря на многочисленные достижения конкурентов и небольшое количество Nikon. Более того, продукты Nikon 1 могут управлять фокусировкой со скоростью до 20 кадров в секунду.По сути, Nikon 1 намного опередил свое время.

Большинство людей обращают внимание именно на 1-дюймовый сенсор. По сравнению с полнокадровым датчиком, Nikon использует этот гораздо меньший датчик, что делает модели Nikon 1 примерно на три шага позади полнокадровых камер, при прочих равных условиях. Но они стоят и за беззеркальными камерами с датчиком m4/3 и датчиком APS.

Не помогло и то, что Nikon сильно завысил цену на Nikon 1, когда он только вышел. По первоначальным ценам камеры просто не продавались. По более поздним сниженным ценам, которые больше отражали стоимость продукта, они продавались прилично.

Хорошей новостью о маленьком датчике является то, что он позволяет использовать очень маленькую камеру и маленькие линзы. Компания Nikon выпустила три самые маленькие беззеркальные модели за всю историю:

  • Серия J — небольшая камера в стиле дальномера, которая использует задний ЖК-дисплей для компоновки (без опции EVF). Эта серия корпусов усовершенствовала одну и ту же базовую камеру в течение пяти лет, плюс она использовалась для создания подводной версии AW1.
  • Серия V — небольшая, больше похожая на цифровую зеркальную камеру камера с электронным видоискателем (встроенным или опциональным). В отличие от серии J, дизайн серии V прыгает повсюду, и ни одна из трех итераций не похожа ни на одну из предыдущих.
  • Серия S — попытка сделать по-настоящему потребительскую, облегченную версию серии J и еще больше уменьшить размер корпуса.

На протяжении всей истории Nikon 1-дюймовые датчики, используемые Nikon, прошли путь от 10-мегапиксельного датчика, поставляемого Aptina (J1), до 20-мегапиксельного, поставляемого Sony (J5), с несколькими промежуточными шагами. С точки зрения качества изображения, только 20-мегапиксельная матрица в J5 соответствует самым высоким современным стандартам для 1 дюйма, что делает J5 предпочтительной моделью Nikon 1 для тех, кто ищет наилучшее качество изображения из этой серии.Но этой модели уже три года, и она не обновлялась.

В плане объективов Nikon был непоследователен.

  • Primes — 10 мм F / 2.8, 18,5 мм F / 1.8 , 32 мм F / 1.2
  • Zooms 6,7-13 мм F / 3. 5-5.6 V R, 10 -30 мм f/3,5–5,6 VR, 11–27,5 мм f/3,5–5,6, 30–110 мм f/3,8–5,6 VR , 10–100 мм f/4,5–5,6 VR, 70–300 мм f/4,5–5,6 VR

Выдающиеся объективы выделены жирным шрифтом в приведенном выше списке.Остальные приличные, но либо не настолько исключительные, чтобы восхищаться, либо имеют недостатки (особенно 11-27,5 мм, у которого отсутствует стабилизация).

Однако в этом списке есть два потрясающих объектива. 32 мм f/1.2, вероятно, лучший портретный объектив для небольших камер, с которым мне приходилось сталкиваться. Это 85-миллиметровый эквивалент, оптически блестящий, а быстрая диафрагма позволяет выделить объект даже для очень маленьких 1-дюймовых сенсоров.

Тем временем 70-300mm f/4.5-5.6 с любым из корпусов Nikon 1 представляет собой самую портативную из доступных комбинаций для съемки дикой природы с большим радиусом действия. У нас эквивалент 800 мм на длинном конце, но вес чуть больше фунта и чуть более 4 дюймов в длину в убранном состоянии. Быстрая автофокусировка камер Nikon 1 в сочетании с небольшим телеобъективом обеспечивает довольно приличную возможность съемки с высоты птичьего полета. По сути, V2 (может быть, V3 с электронным видоискателем) и 70-300 мм — это наслаждение для орнитологов.

Одним из неприятных аспектов серии Nikon 1 является то, что все аксессуары — вспышка, GPS и т.— несовместимы с аксессуарами DSLR, и наоборот. Это просто очень плохое решение со стороны Nikon, хотя они повторно использовали некоторые батареи DSLR в камерах Nikon 1.

Плохая новость в том, что Nikon полностью отказался от линейки Nikon 1. Пока я пишу эти строки, несколько моделей остаются в запасе, но если вас интересует система Nikon 1, вы, скорее всего, будете покупать ее на рынке бывших в употреблении.

LAX Southwest Airlines, Терминал 1 Cx

Необходимо (Обязательно)

Файлы cookie, без которых сайт не может нормально функционировать. Это включает файлы cookie для доступа к безопасным областям и безопасности CSRF. Обратите внимание, что файлы cookie по умолчанию Craft не собирают никакой личной или конфиденциальной информации. Файлы cookie по умолчанию Craft не собирают IP-адреса. Информация, которую они хранят, не отправляется Pixel & Tonic или каким-либо третьим сторонам.

Имя : CraftSessionId

Описание : Craft использует сеансы PHP для поддержки сеансов через веб-запросы.Это делается с помощью файла cookie сеанса PHP. По умолчанию имя файла cookie «CraftSessionId», но его можно переименовать с помощью настройки конфигурации phpSessionId. Срок действия этого файла cookie истечет, как только завершится сеанс.

Провайдер : этот сайт

Срок действия : Сессия

Имя : CRAFT_CSRF_TOKEN

Описание : Защищает нас и вас как пользователя от атак с подделкой межсайтовых запросов.

Провайдер : этот сайт

Срок действия : Сессия

Статистика (обязательно)

Статистические файлы cookie помогают нам понять, как посетители взаимодействуют с веб-сайтами, собирая и сообщая информацию анонимно.

Имя : _ga

Описание : Это имя файла cookie связано с Google Universal Analytics, что является значительным обновлением более часто используемой аналитической службы Google. Этот файл cookie используется для различения уникальных пользователей путем присвоения случайно сгенерированного числа в качестве идентификатора клиента.Он включается в каждый запрос страницы на сайте и используется для расчета данных о посетителях, сеансах и кампаниях для аналитических отчетов сайтов. По умолчанию срок действия истекает через 2 года, хотя это может быть настроено владельцами веб-сайтов.

Провайдер : Google

Срок действия : Постоянный

Имя : _gid

Описание : Это имя файла cookie связано с Google Universal Analytics. Он используется для записи начала и окончания каждого посещения веб-сайта. Он истекает через 24 часа.

Провайдер : Google

Срок действия : 24 часа

Имя : _gat_gtag_UA_*

Описание : Это имя файла cookie связано с Google Universal Analytics.Он используется для определения уникальных посетителей на сайте. Он истекает через 10 минут.

Провайдер : Google

Срок действия : 10 минут

Имя : пардо

Описание : Этот файл cookie связан с услугами платформы автоматизации маркетинга и генерации лидов Pardot.

Провайдер : Пардо

Срок действия : Сессия

Имя : lpv######

Описание : Этот файл cookie связан с услугами платформы автоматизации маркетинга и генерации лидов Pardot.

Провайдер : Пардо

Срок действия : 30 минут

Имя : идентификатор_посетителя######

Описание : это шаблон cookie, который добавляет уникальный идентификатор посетителя веб-сайта, используемый для целей отслеживания. Срок действия файлов cookie в этом домене составляет 10 лет.

Провайдер : Пардо

Срок действия : 10 лет

Имя : идентификатор_посетителя######-хэш

Описание : это шаблон cookie, который добавляет уникальный идентификатор посетителя веб-сайта, используемый для целей отслеживания.Срок действия файлов cookie в этом домене составляет 10 лет.

Провайдер : Пардо

Срок действия : 10 лет

Руководство по эксплуатации камеры Cosina CX-1, Cosina CX-2, руководство пользователя, руководство по эксплуатации в формате PDF

Руководство по эксплуатации камеры Cosina CX-1, Cosina CX-2, руководство пользователя, руководство по эксплуатации в формате PDF Cosina CX-1 / CX-2
Опубликовано 19 августа 2002 г.

Эта библиотека руководств по эксплуатации камеры предназначена для справочных и исторических целей. права защищены.
Авторские права на эту страницу принадлежат M. Butkus, NJ.
Эта страница не может быть продана или распространена без выраженного разрешение производителя.
У меня нет связи ни с одной компанией по производству фотоаппаратов.

Он-лайн библиотека руководств по камерам

Если вы найдете это руководство полезным, как насчет пожертвования в размере 3 долларов США:

М. Буткус, 29 Lake Ave., High Bridge, NJ 08829-1701
и отправьте свой адрес электронной почты, чтобы я мог Спасибо.
В большинстве других мест с вас возьмут 7 долларов.50 за электронную копию
или 18 долларов за трудночитаемая ксероксная копия.

 

Это поможет мне продолжать размещать этот сайт,
покупать новые руководства и оплачивать их доставку.
Тебе станет легче, правда?

Если вы используете Pay Pal, воспользуйтесь ссылкой ниже.
Используйте указанный выше адрес для чека, M.O. или наличными.

Щелкните здесь, чтобы перейти на главный сайт руководства по эксплуатации камеры


НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ПРОДОЛЖИТЬ PDF
Cosina CX-1 / CX-2 РУКОВОДСТВО СДЕЛАНО ИЗ ЭТОГО ФАЙЛА

АНГЛИЙСКИЙ

Добро пожаловать в захватывающий мир COSINA.Ваша новая камера принадлежит к семейству профессиональных Качественные камеры, разработанные специально для серьезных фотографов. И имя КОЗИНА твое гарантия превосходно изготовленной оптики и выдающихся механических характеристик и надежности.

Технические характеристики

Тип: Миниатюра 35 мм, линзовый затвор, программируемая камера EE.

Пленка Формат: 24 мм X 36 мм

Объектив: COSINON f=33mm F=3.5 из 3 групп и 4 элементов (CX-1)

        COSINON f=35 мм F=2.8 из 5 групп и 5 элементов (СХ-2)

Затвор: Программируемый автоматический затвор со встроенным автоспуском (CX-2)

Контакты вспышки: контакты «горячий башмак», синхронизация «X» 1/45 секунд F2,8~16

Видоискатель: Тип яркой рамки (Albada), оснащенный меткой компенсации параллакса, меткой фокусировки (CX-2), зеленым светодиодом проверки заряда батареи (светится когда все в порядке) и красный предупреждающий светодиод для длинной выдержки. (загорается, когда выдержка превышает 1/45 с.), Увеличение: 0,5X

Регулировка фокуса:
Система фокусировки по зонам. В видоискателе доступны 4 символа. (только CX-2) и окно метки символа фокусировки. Ближайшее расстояние съемки: 0,9 м

Система измерения: Программируемая система EE с CdS. EE Диапазон соединения: ASA 100 EV2 — EV17 (ASA 100) Диапазон светочувствительности пленки: ASA 25 — 400 (DIN 15-27) Источник питания: 2 шт. щелочных (или оксидно-серебряных) батареек типа SR44 1,5В.

Транспортировка пленки: заднее продвижение (ручка).Дуга хода холостого хода — 360 градусов, счетчик кадров сбрасывается автоматически, перемотка пленки кривошипной системой.

Отличительные особенности: Автоматическая намотка, адаптируемая для дополнительного устройства намотки, обеспечивающего подачу пленки со скоростью до 1 кадра в секунду (только CX-2). Доступна АВТОМАТИЧЕСКАЯ ВСПЫШКА CX-11.

Размеры: 103X66X42,5 мм

Вес: 225 г (без батарей) CX-2, 215 г (без батарей) CX-1

1. ОПИСАНИЕ ЧАСТЕЙ

(1) Ручка подачи пленки

(2) Счетчик кадров

(3) Кнопка спуска затвора

(4) Стержень с крючком для ремешка на запястье

(5) Рычаг диафрагмы

(6) Автоспуск (CX-2)

(7) Горячий башмак

(8) Рукоятка перемотки пленки

(9) Ручка перемотки пленки

(10) Видоискатель

(11) Линза фотосенсора

(12) Регулятор скорости пленки

(13) Индикатор светочувствительности пленки

(14) Символ фокусировки

(15) Объектив Блокировка автоматической крышки/спуска затвора

(16) Объектив камеры

(17) Рычаг фокусировки

(18) Кинокамера

(19) Электрические контакты обмотки (CX-2)

(20) Гнездо для штатива


(21) Крышка батарейного отсека

(22) Перемотка пленки Burton

(23) Муфта намотки (CX-2)

(24) Звездочка подачи пленки

(25) Приемная катушка


(26) Задняя крышка

(27) Прижимная пластина для пленки

(28) Окуляр видоискателя

(29) Отверстие для установочного штифта намотки (CX-2)

(30) Направляющая для пленки

2. Установка батарей

1. Откройте крышку батарейного отсека (21), повернув ее против часовой стрелки с помощью монеты.

2. Вставьте две щелочные батареи 1,5 В типа LR44 (A-76) (или SR44 TYPE на основе оксида серебра) в батарейный отсек положительной (+) стороной вверх.

3. Установите на место крышку батарейного отсека (21), полностью повернув ее по часовой стрелке.

4. Примечание. Протирайте батареи сухой тканью или бумагой перед их установкой, а затем через регулярные промежутки времени.Убедитесь, что батарейки вставлены правильно, т.е. проверьте полярность. Затвор будет работать только при правильно установленных и не разряженных батареях.

3. Проверка аккумулятора

1. Проверяйте батареи, когда
—вставлен новый комплект батареек.
—камера долгое время не использовалась
— камера используется непрерывно в течение многих часов.


2.Чтобы проверить батареи, полностью поверните замок автоматической крышки объектива/затвора (15) по часовой стрелке и слегка нажмите кнопку спуска затвора (3).

3. Если батарейки в порядке, загорится зеленый светодиод, расположенный в верхней части видоискателя.

4. Если зеленый светодиод не загорается, это означает, что батареи слишком разряжены и нуждаются в замене, или они вставлены неправильно.

4. Загрузка пленки

Чтобы загрузить камеру:

1.Нажмите кнопку спуска затвора, чтобы очистить механизм камеры.

2. Откройте заднюю часть камеры, откинув и подняв рукоятку перемотки пленки (8), пока задняя часть не откроется со щелчком.

3. Вставьте кассету с пленкой в ​​отсек для пленки (18), затем нажмите на ручку перемотки пленки (9) и слегка поверните ее, чтобы зафиксировать кассету на месте.

4. Протяните направляющую пленки через заднюю часть камеры и вставьте конец направляющей в один из пазов приемной катушки пленки. (25).

5.Когда рукоятка перемотки пленки находится в выдвинутом положении, слегка перемотайте пленку, чтобы устранить провисание в кассете с пленкой. Перепроверьте, чтобы убедиться, что пленка осталась закреплены на приемной катушке и что перфорация совмещена с звездочками (24). Сложите рукоятку перемотки вниз.


6. Плотно закройте заднюю крышку камеры (26) до щелчка, указывающего на то, что крышка зафиксирована в закрытом положении. Продвиньте пленку, альтернативно наматывая пленку Перемещайте ручку продвижения вперед (1) и нажимайте кнопку спуска затвора (3) до тех пор, пока счетчик кадров (3) не сбрасывается между «0» и «2».Когда ручка подачи пленки вращается, ручка перемотки пленки должна вращаться, показывая, что пленка продвигается правильно. Камера сейчас готовы к первой экспозиции.

5. Счетчик кадров

1. Счетчик кадров (2) отображает количество сделанных снимков и автоматически сбрасывается при открытии задней крышки. (26).

2. Когда задняя крышка (2) открыта, счетчик кадров (2) указывает «S» на начало процесса съемки.

3.Когда пленка загружена ранее описанным способом (см. «Загрузка пленки»), счетчик должен оставаться между «0» и «2», указывая на то, что камера готова к первой экспозиции.

4. Счетчик будет увеличиваться на одну отметку за каждый использованный кадр.

5. Отображаются только четные числа. Пунктирные квадратные метки указывают на нечетные номера кадров.

6. Цифры 12, 20, 24 и 36 окрашены в оранжевый цвет, указывая на конец общедоступных пленок.

6.Продвижение фильма

1. Убедитесь, что пленка правильно загружена.

2. Для продвижения пленки просто поверните ручку продвижения пленки (1) против часовой стрелки, пока она не сделает один оборот.

3. В конце фильма ручка может остановиться до полного поворота. Никогда не заставляйте это.

4. Не пытайтесь перематывать дальше, а нажмите кнопку перемотки пленки (22) и перемотайте пленку обратно в кассету.

5. Для максимального удобства, Cosina «Auto-winder CX-W» был разработан для крепления к опорная плита CX-2, обеспечивающая непрерывную подачу пленки со скоростью до 1 кадра в секунду.


7. Настройка скорости пленки

1. Скорость ASA/DIN пленки указана на коробке или в инструкции, прилагаемой к пленке.

2. Установите индикатор скорости пленки (13) на необходимое значение ASA/DIN, повернув ручку скорости пленки (12).
Примечание. Нельзя использовать неустановленное положение.

3. Всегда проверяйте, соответствует ли индикатор скорости пленки рейтингу ASA используемой пленки.

8. Держа камеру

1. Положите камеру на левую ладонь так, чтобы пальцами поворачивать рычаг фокусировки объектива.

2. Слегка держите корпус камеры, слегка положив указательный палец правой руки на кнопку спуска затвора.

3. Слегка прижмите левый локоть к телу и посмотрите в видоискатель, прижав камеру к лицу. Правая рука должна быть расслаблена во время держит камеру.


Примечание:
1.Не нажимайте ручку перемотки пленки при протягивании пленки.

2. Будьте осторожны, не закрывайте объектив фотосенсора и объектив камеры пальцами во время съемки.

9. Фокусировка и настройка композиции

1. Установите метку символа фокусировки (14), перемещая рычаг фокусировки (17). Поскольку метки символов видны и в видоискателе, фокусировку можно настроить через видоискатель. (только CX-2)

2. Установите метку символа в соответствии с приблизительным расстоянием до объекта.

3. Поместите объект, который хотите снять, в яркую рамку в видоискателе.

4. При съемке на расстоянии (0,9 м) объект не должен выходить за пределы метки компенсации параллакса.


10. Стрельба

Для автоматической экспозиции с Cosina CX-2 просто:

1. Установите рычаг диафрагмы s в положение «Авто».

2. Поверните замок спуска затвора по часовой стрелке.

3. Протяните пленку с помощью ручки подачи пленки (или устройства автоматической намотки, если оно установлено)

4. Слегка нажмите кнопку спуска затвора 3. (Зеленый светодиод указывает на то, что батареи в порядке).

5. Когда горит красный светодиод (указывающий на выдержку менее 1/30 с), камеру следует держать очень устойчиво или желательно установить на штатив. То Затем кнопку спуска затвора следует нажимать очень плавно, чтобы избежать сотрясения камеры. (Чтобы обеспечить правильную экспозицию фотографий, мы рекомендуем использовать Cosine CX-11 «Автовспышка» всякий раз, когда загорается красный сигнал светодиода).

6. Наконец, перед спуском затвора тщательно проверьте правильность кадра объекта съемки в видоискателе.


11. Автоспуск

(CX-2) Автоспуск задерживает срабатывание затворного механизма на примерно 10 секунд, что позволяет вам включить себя в фотографию при желании. Перед активацией автоспуска камеру следует установить на штатив или твердую поверхность и сфокусировать на соответствующем расстоянии.Активировать Автоспуск: 1. Поверните рычаг автоспуска (6) по часовой стрелке до упора. Теперь автоспуск «заведен» и готов к использованию.

12. Перемотка пленки

Когда последний кадр вашей пленки был экспонирован:

1). Нажмите кнопку перемотки пленки (22) на камере.

2). Откиньте рукоятку перемотки пленки 48) и поверните в направлении стрелки.

3). Когда рукоятка повернется (8) свободно (без напряжения) или «тянется», потяните вверх рукоятку перемотки, пока задняя часть камеры не откроется со щелчком.

4). Выньте кассету с экспонированной пленкой из-под прямых солнечных лучей и при необходимости замените кассету со свежей пленкой.

5). Верните рукоятку перемотки в исходное положение и закройте заднюю часть камеры.

13. Фотосъемка со вспышкой

Ультракомпактный Cosina CX-11 «Auto-Flash» был специально разработан для использования с Косина СХ-2.

1). Вставьте CX-11 «Auto-Flash» в горячий башмак I CX-2.

2). Переместите рычаг диафрагмы I) на соответствующее значение диафрагмы, нажимая в направлении стрелки и перемещая рычаг вверх или вниз.

(Подробнее см. в инструкции, прилагаемой к CX-11 «Auto-Flash»)

14. Фотосъемка с автомотальщиком «CX-W»

Cosina Autowinder «CX-W» был специально разработан для работы с Cosine CX-2, обеспечивая автоматическую намотку со скоростью до 1 кадра в секунду.

Установка CX-Autowinder:

1). Прикрепите Autowinder к основанию CX-2, убедившись, что электрические контакты устройства намотки (19), муфта моталки (23) и отверстие для установочного штифта моталки (29) правильно совмещены.

2). Затяните винт.

3). Установите выключатель питания Autowinder в положение «ON».

(Подробнее см. в инструкции, прилагаемой к CX-Autowinder).

CAMM-1 CX-24 24-дюймовый резак для винила | Roland DGA

Windows 10

Roland не предлагает драйвер поддержки Windows 10 для этого устаревшего резца Roland DG CAMM-1 Cutter

.

249.61 КБ

Windows 2000, Windows ХР

Модель: GX-24, GX-300, GX-400, GX-500, CX-12, CX-24, CX-300, CX-400, CX-500, СМ-12, СМ-24, СМ-300, СМ-400, СМ-500 Пожалуйста, обратитесь к файлу readme.txt для деталей

52,32 КБ

Windows 7

Roland не предлагает поддерживающий драйвер для Windows 7 для этого устаревшего резака Roland DG CAMM-1 Cutter

.

249.64 КБ

Windows 8

Roland не предлагает поддерживающий драйвер для Windows 8 для этого устаревшего резца Roland DG CAMM-1 Cutter

.

249.63 КБ

Виндовс 95/98

Драйвер резака CAMM-1 для Windows 95 98 GX-24300400500, CX-1224300400500, CM-1224300400500 Все модели резаков PNC. Пожалуйста, используйте SETUP.exe в извлеченной папке. Пожалуйста, обратитесь к readme.txt

481,35 КБ

Windows Me

Драйвер резака CAMM-1 для Windows ME GX-серия.CX-Series, CM-Series все модели PNC. Пожалуйста, используйте SETUP.exe в извлеченной папке. Пожалуйста, обратитесь к readme.txt

481,35 КБ

Виндоус виста

Модель: GX-24, GX-300400500, CX-1224, CX-300400500

36. 99 КБ

Windows XP

Драйвер CAMM-1 для Windows XP, версия 1.10, 32 бит Модель: GX-24, GX-640500400300. CX1224300400500 СМ-1224300400500

8.82 МБ

ClickShare CX-20 — беспроводная система конференц-связи

Начать совещание со своего устройства

ClickShare CX-20 обеспечивает беспроводную конференц-связь одним щелчком мыши. Начинать гибридные видеовстречи со своего устройства стало проще, чем когда-либо. С нашей независимой беспроводной системой для конференц-залов вы начинаете гибридную конференцию со своего ноутбука, используя предпочитаемый вами инструмент для проведения конференций, менее чем за семь секунд.Входите, автоматически подключайтесь к комнатным устройствам, таким как камеры, микрофоны, динамики, саундбары, экономя время и повышая эффективность. Организуйте гибридную совместную работу одним щелчком мыши. Для сотрудников и гостей.

Решите, как вы хотите сотрудничать

ClickShare CX-20 предоставляет вам исключительную гибкость и возможность выбора, позволяя вам решать, как именно вы хотите сотрудничать. Подключи и работай с помощью кнопки ClickShare и выбери интеграцию рабочего процесса с приложением, чтобы сделать встречи интуитивно понятными и интерактивными.И то, и другое облегчает взаимодействие с пользователем, которое является одновременно простым и последовательным. Наслаждайтесь полезными функциями, такими как локальный просмотр дисплея комнаты и интеграция с календарем.

ClickShare CX-20 также не зависит от технологий и полностью совместим с технологией вашей платформы конференц-связи (UC) и широким спектром USB-периферийных устройств. Дополнительные функции, такие как локальный вид дисплея комнаты, помогут вам оптимизировать процесс встречи одним щелчком мыши.

Повышенная безопасность и бесшовная интеграция

Набор удобных для ИТ функций делает ClickShare Conference идеальным решением для любой корпоративной среды.ClickShare Conference, отличающаяся повышенной безопасностью, легко интегрируется в любую ИТ-сеть. С облачной платформой управления XMS вы получаете простое управление устройствами, интуитивно понятный пользовательский интерфейс и четкую аналитику для управления цифровым рабочим местом.

Если у вас возникнут практические вопросы по сетевому развертыванию серии ClickShare Conference, обратитесь в нашу службу технической поддержки или свяжитесь с вашим представителем Barco.

 

CX-5461 активирует реакцию на повреждение ДНК и демонстрирует терапевтическую эффективность при высокозлокачественном серозном раке яичников

Активность CX-5461 в клеточных линиях OVCA

Эффекты CX-5461 in vitro на человеческие клетки OVCA оценивали с использованием панели из 32 установленных линий клеток OVCA человека. Эти клеточные линии были выбраны как репрезентативные для ряда гистологических подтипов OVCA (дополнительная таблица 1). Возрастающие концентрации (1 нМ–10 мкМ) CX-5461 использовали для оценки концентрации лекарственного средства, вызывающей 50% снижение клеточной пролиферации (GI 50 ) через 48 часов (ч). Значения GI 50 варьировались между отдельными клеточными линиями и варьировались от 12 нМ для OVCAR3 до 5,17 мкМ для OV90 (рис. 1а). Клеточные линии определяли как чувствительные к CX-5461, если GI 50 был ниже геометрической медианы 363 нМ.Не было статистически значимой корреляции между статусом мутации TP53 и чувствительностью к CX-5461 (дополнительная таблица 1, рис. 1b). Эффективность ингибирования роста с помощью CX-5461 коррелировала с более высокой скоростью базовой транскрипции рДНК в чувствительных по сравнению с резистентными клеточными линиями OVCA (рис. 1с). Однако как чувствительные, так и устойчивые к CX-5461 клеточные линии демонстрировали одинаковые уровни ингибирования транскрипции Pol I после 1-часовой обработки CX-5461 с концентрациями, которые ингибируют транскрипцию Pol I на 50% (IC 50 ) в диапазоне от 38 до 285. нМ (рис.1г и д). Данные показывают, что CX-5461 является целевым в ингибировании транскрипции Pol I в дозах, в 10 раз меньших, чем диапазон концентраций в плазме (584,1 нМ–3,3 мкМ), используемый в исследовании повышения дозы CX-5461 фазы I 16 .

Рис. 1: Чувствительность клеточных линий рака яичников (OVCA) к CX-5461.

a дозы CX-5461, вызывающие 50% ингибирование роста (GI 50 ) через 48 часов. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± стандартное отклонение (SD). Звездочки обозначают мутировавший статус TP53 .Среднее геометрическое GI 50 доза 363 нМ обозначена тонкой линией. Информация относительно источника каждой клеточной линии, средних значений G1 50 , значений SD и N представлена ​​в дополнительной таблице 1. Выделенные 12 чувствительных к CX-5461 и 11 устойчивых к CX-5461 клеточных линий были использованы для идентификации CX- Сигнатуры экспрессии генов чувствительности 5461 на рис.  2а. b CX-5461 GI 50 доз TP53 дикого типа и TP53 мутантных клеточных линий OVCA, как указано в ( a ).Статистический анализ проводили с использованием двустороннего критерия Манна-Уитни. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± ± стандартное отклонение. c Базовые уровни транскрипции рДНК клеточных линий OVCA (перечислены в ( d )), определенные с помощью количественного анализа ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) с использованием праймеров, специфичных к внешнему транскрибируемому спейсеру 5’ETS (+413– 521 bp) относительно сайта начала транскрипции (TSS). Уровни экспрессии в каждой клеточной линии нормализовали по мРНК виментина и выражали как кратность изменения по сравнению с клетками TOV112D.Каждая точка представляет собой среднее значение n  = 3 биологически независимых экспериментов на клеточную линию (отдельные точки данных представлены в дополнительных данных 4). Столбики погрешностей представляют собой среднее ± ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с использованием двустороннего непарного теста t . d Кривые доза-реакция уровней рРНК-предшественника 47S, измеренные с помощью количественной ОТ-ПЦР. Линии клеток OVCA обрабатывали носителем или возрастающими концентрациями препарата CX-5461 (0,001, 0,01, 0,03, 0,1, 0,001, 0,01, 0,03, 0,1, 0,001,3, 1 и 3 мкМ) за 1 ч до сбора РНК. Уровни экспрессии нормализовали по мРНК виментина и выражали как кратное изменение по сравнению с контролями, обработанными носителем. Показаны средние значения n  = 3 независимых биологических экспериментов для каждой клеточной линии. (Отдельные точки данных представлены в дополнительных данных 4). e Представлены средние значения ингибирующей концентрации, которые привели к 50% ингибированию транскрипции (IC 50 ) (из n  = 3 биологически независимых экспериментов для каждой клеточной линии) из D (отдельные точки данных представлены в дополнительных данных 4 ).Столбики погрешностей представляют собой среднее ± ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с использованием двустороннего критерия Манна-Уитни.

CX-5461 демонстрирует синтетическую летальность с HRD в HGSOC

Для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе чувствительности CX-5461 к OVCA, были созданы профили экспрессии генов для 12 чувствительных к CX-5461 и 11 устойчивых клеточных линий (рис. 1a). . Анализ обогащения набора генов (GSEA) выявил мутацию BRCA1, а MYC нацелен на сигнатуры экспрессии генов, чтобы коррелировать с чувствительностью к CX-5461 in vitro (рис.2а, дополнительный рис. 1). Действительно, мы наблюдали значительное обогащение сигнатуры экспрессии гена HRD 24 в CX-5461-чувствительных клеточных линиях (рис. 2b). Однако корреляция чувствительности CX-5461 и PARPi в клеточных линиях HGSOC не была очевидной (дополнительная рис. 2), что указывает на то, что дополнительные механизмы HRD придают чувствительность к CX-5461. Уровень мутации BRCA1 (BRCAm-sig) и сигнатуры экспрессии гена онкогенного MYC (MYC_UP-sig) точно различают CX-5461-чувствительные и резистентные клеточные линии в независимом наборе данных из Энциклопедии раковых клеток Института Броуда (CCLE). (Рисунок.2с). Мы обнаружили, что использование сигнатур экспрессии генов BRCAm-sig и MYC_UP-sig обеспечивает большую мощность для прогнозирования чувствительности к CX-5461, чем использование BRCAm-sig в ​​качестве единственного предиктора (критерий хи-квадрата ANOVA p — значение   =   0,026557). Действительно, чувствительность к CX-5461 также была связана с высокой базовой скоростью транскрипции Pol I (рис. 1c). Поскольку известно, что высокая активность MYC управляет транскрипцией Pol I на нескольких уровнях 25 , данные согласуются с повышенной активностью MYC, вызывающей чувствительность к CX-5461.Взятые вместе, наши данные показывают, что CX-5461 может обеспечить терапевтическую пользу в подтипе HGSOC с высоким уровнем MYCN, классифицированном с повышенной функциональной активностью MYC и плохой выживаемостью без прогрессирования 26,27 .

Рис. 2: Чувствительность к CX-5461 связана с индуцированными генами-мишенями MYC, мутациями BRCA1 и признаками экспрессии генов HRD.

a GSEA данных экспрессии микрочипов 12 чувствительных к CX-5461 и 11 устойчивых к CX-5461 клеточных линий (рис. 1a). Показаны графики обогащения наборов генов, которые, как было установлено, обогащены CX-5461-чувствительными клеточными линиями. b GSEA одного образца (ssGSEA) использовали для определения уровня активности сигнатуры экспрессии гена HRD 24 в отдельных образцах. Гены в каждом образце были ранжированы в соответствии с уровнями их экспрессии, и оценка для каждого пути была получена на основе эмпирической кумулятивной функции распределения, отражающей, насколько высоко или низко были обнаружены гены в ранжированном списке. n  = 32 клеточных линии на рис. 1a, прямоугольная диаграмма — медиана, верхняя и нижняя петли соответствуют первому и третьему квартилям (25-й и 75-й процентили).Верхний ус простирается до наибольшего значения не более чем на 1,5*IQR (IQR = межквартильный диапазон). Нижний ус простирается до наименьшего значения 1,5*IQR. Данные за пределами усов отображаются в виде отдельных точек. Статистическая значимость была получена с использованием двусторонних критериев Уилкоксона. c Уровень экспрессии генов-мишеней MYC (MYC_UP-sig) и сигнатуры гена с мутацией BRCA1 (BRCAm-sig) рассчитывали по данным экспрессии РНК из Broad Institute CCLE с использованием ssGSEA. Сигнатуры экспрессии генов MYC_UP-sig и BRCAM-sig более выражены в CX-5461-чувствительной группе по сравнению с резистентной группой (односторонний тест Уилкоксона p — значение 0.004762 и 0,009524 соответственно). d Комбинация CX-5461 и siРНК, нацеленных на гены HR в клетках OVCAR4, синергически ингибирует пролиферацию. Четыре отдельных дуплекса миРНК на ген подвергали обратной трансфекции в течение 24 часов с последующей обработкой CX-5461 (80 нМ) или носителем в течение 48 часов. Количество клеток измеряли с использованием окрашивания DAPI и визуализировали с помощью Cellomics. n  = 4, каждая точка данных представляет отдельные дуплексы миРНК. Столбики погрешностей представляют собой среднее значение ± SEM (стандартная ошибка среднего).Статистический анализ проводили с использованием двустороннего одностороннего ANOVA, критерия множественных сравнений Тьюки (показаны скорректированные значения p ). Сопровождающий график (справа) представляет собой график блаженства, где каждая точка представляет отдельный дуплекс миРНК. Комбинированный индекс CI < 1 указывает на синергизм, CI > 1 указывает на антагонизм и CI = 1 указывает на аддитивный эффект.

Чтобы подтвердить синтетическое летальное взаимодействие CX-5461 с HRD, мы проверили влияние коротких интерферирующих РНК (siRNAs), нацеленных на гены HR, на эффективность CX-5461 и продемонстрировали сильное синергетическое ингибирование в клетках HGSOC OVCAR4, которые, как сообщается, очень напоминают геномные профиль опухолей HGSOC 28 (рис.2г). Кроме того, мы проверили ингибирующие рост эффекты CX-5461 в изогенно согласованных HR-способных клетках OVCAR8 и производной HR-дефицитной RAD51C нокаутной (KO) клеточной линии OVCAR8, ранее характеризовавшейся отсутствием способности образовывать фокусы RAD51 в ответ на ионизирующее излучение ( IR) 29 (дополнительная рис. 3a–c. Линия клеток с дефицитом HR проявляла повышенную чувствительность к ингибированию роста CX-5461 при низких дозах 10 и 100 нМ по сравнению с клетками OVCAR8 (рис. 3a). В HR -способных клеток OVCAR8, CX-5461-опосредованное ингибирование пролиферации было связано с выраженной остановкой клеточного цикла G2/M, измеренной с помощью окрашивания BrdU/PI (фиг.3b и дополнительный рисунок 3D) и с использованием репортерной системы FUCCI (рис. 3c и дополнительный рисунок 3E). Клетки OVCAR8, обработанные CX-5461, также демонстрировали нарушение цитокинеза и многоядерность (содержание ДНК 8 N) (рис. 3d и дополнительная рис. 3D), что позволяет предположить, что CX-5461 вызывает дефекты сегрегации хромосом, возможно, из-за постоянного стресса репликации ДНК и повреждения ДНК в митоз 30 . Для сравнения, HR-дефицитные клетки RAD51C KO OVCAR8 подвергались клеточной гибели при 100 нМ и 1 мкМ CX-5461, что еще раз подтверждает синтетическое летальное взаимодействие CX-5461/HRD (рис.3d и дополнительный рисунок 3D).

Рис. 3: CX-5461 является синтетическим летальным с HRD в HGSOC.

a In vitro CX-5461 доза-реакция пролиферации во времени, оцениваемая по слиянию клеток с использованием IncuCyte ZOOM клеточных линий OVCAR8 и OVCAR8 RAD51C KO. Представитель двух биологически независимых экспериментов. Столбики погрешностей представляют собой среднее  ± SEM для n  = 5 технических повторов. b Анализ клеточного цикла клеток, обработанных носителем, 100 нМ или 1 мкМ CX-5461 в течение 48 часов и 72 часов и меченных BrdU в течение 30 минут перед сбором.Был проведен аналитический FACS-анализ включения BrdU в зависимости от содержания ДНК (репрезентативные графики и стратегия селекции показаны на дополнительном рисунке 3D). Графики гистограммы, отображающие процент популяций клеток G0/G1 (синий) и G2M (зеленый) и S-фазы, меченных BrdU (красный). Столбики погрешностей представляют собой среднее  ± SEM n  = 3 биологически независимых экспериментов. c Количественное определение профилей клеточного цикла с использованием клеток, меченных FUCCI, обработанных носителем, 100 нМ или 1 мкМ CX-5461 в течение 48 и 72 часов.Репрезентативные профили проточной цитометрии и стратегия гейтирования показаны на дополнительном рисунке 3E. Столбики погрешностей представляют собой среднее  ± SEM n  = 3 биологически независимых экспериментов. d Графики гистограммы, отображающие процент клеток с содержанием ДНК > 4n (верхняя панель) и клеточные популяции Sub G0/G1 (нижняя панель), обнаруженные с помощью анализа клеточного цикла BrdU/PI, описанного в ( b ) и на дополнительной рис. 3D, ( n  = 3 биологически независимых эксперимента, n  = 7 для клеток OVCAR8 и OVCA8 RAD51C KO, обработанных носителем или 1 мкМ CX-5461 в течение 72 часов), планки погрешностей представляют среднее значение  ±SEM.Статистический анализ в B-D был выполнен с использованием двустороннего одностороннего ANOVA, критерия множественных сравнений Тьюки (показаны скорректированные значения p ). e Вестерн-блот-анализ клеток, обработанных носителем, 100 нМ или 1 мкМ CX-5461 в течение 6 и 24 часов. Представитель n  = 3 биологически независимых экспериментов. Показанные блоты представляют собой образцы, полученные из одного и того же эксперимента и обработанные параллельно. Нанесение контролей Винкулин и Актин обрабатывали путем повторного зондирования блотов.Полноразмерное сканирование вестерн-блотов представлено на дополнительном рисунке 10.

Затем мы исследовали опосредованную CX-5461 активацию передачи сигналов ATM / ATR в клеточных линиях HGSOC (рис. 3e). В соответствии с нашими предыдущими выводами 19 , CX-5461 индуцирует передачу сигналов ATM/ATR, о чем свидетельствует повышенное фосфорилирование ATR T1989, ATM S1981, CHK1 S345, CHK2 T68 и низкая индукция уровней γh3AX в обеих клеточных линиях. Большее увеличение фосфорилирования S4/S8 RPA32 (репликационный белок А), который защищает одноцепочечную ДНК (оцДНК), наблюдалось в клетках с дефицитом HR после 100 нМ и 1 мкМ CX-5461 по сравнению с клетками OVCAR8, способными к HR, что указывает на стойкую остановку вилки репликации 31 . Таким образом, CX-5461 индуцирует стресс репликации в HR-способных клетках, связанный с повышенным процентом многоядерных клеток, в то время как HR-дефицитные клетки подвергаются клеточной гибели после обработки CX-5461 из-за усиленного репликационного стресса. В целом, эти результаты демонстрируют, что CX-5461 проявляет сильные антипролиферативные эффекты в клетках OVCA и что дефекты HR повышают чувствительность клеток HGSOC к CX-5461-опосредованной гибели клеток, что согласуется с признаками экспрессии гена BRCA1 и HRD, предсказывающими чувствительность клеток OVCA к CX- 5461 (рис.2а, б).

CX-5461 индуцирует репликационный стресс и DDR

Чтобы изучить механизм активации передачи сигналов ATM/ATR, мы исследовали влияние обработки CX-5461 на формирование структур GQ в клетках OVCAR8, OVCAR8 RAD51C KO и OVCAR4 (рис. . 4a, b и дополнительный рисунок 4A–D). CX-5461 не индуцировал стабилизацию GQ ни в HR-способных клетках OVCAR8 или OVCAR4, ни в HR-дефицитных клетках OVCAR8 RAD51C KO по сравнению с добросовестным стабилизатором GQ (TMPyP4) через 1 час, 3 часа и 24 часа после обработки. Интересно, что окрашивание GQ значительно уменьшилось в клетках OVCAR8, обработанных CX-5461 в течение 3 часов. Кроме того, в отличие от лечения CX-5461, TMPyP4 не активировал DDR через 1 час после лечения, когда наблюдалось значительное увеличение стабилизации GQ (дополнительная рис. 4C-E). Наши данные ясно демонстрируют, что CX-5461-опосредованная активация DDR не связана со стабилизацией GQ. Это открытие противоречит предыдущему отчету о клетках рака толстой кишки 17 , предполагая, что опосредованный CX-5461 эффект на стабилизацию GQ может зависеть от типа клеток.

Рис. 4: CX-5461 индуцирует стабилизацию R-петлей в HR-способных клетках OVCAR8.

a Коиммунофлуоресценция (Co-IF) ДНК GQ и UBF в качестве ядрышкового маркера в клетках OVCAR8 и клетках OVCAR8 RAD51C KO, обработанных либо носителем, 1 мкМ CX-5461, либо 10 мкМ TMPyP4 в течение 3 часов. Репрезентативные изображения трех биологически независимых экспериментов. b Количественный анализ иммунофлуоресценции ДНК GQ. Интенсивность сигнала анализировали с помощью CellProfiler. Столбики погрешностей представляют собой среднее  ± SD, n  = 200 клеток на условие лечения, исследованное в трех независимых экспериментах. c Co-IF анализ R-петлей и UBF в клетках, обработанных носителем или 1 мкМ CX-5461 в течение 3 часов. Репрезентативные изображения двух биологически независимых экспериментов. d Количественную оценку интенсивности сигнала R-петлей проводили с использованием CellProfiler. n  = 230 клеток на условие лечения исследовали в двух независимых экспериментах. Интегральную интенсивность нормализовали к соответствующему среднему значению контроля носителя OVCAR8. Статистический анализ в ( b ) и ( d ) был выполнен с использованием одностороннего одностороннего ANOVA, критерия множественных сравнений Крускала-Уоллиса (показаны скорректированные значения p ).(ns) обозначает незначительное p значение больше 0,05. e Клетки обрабатывали носителем, 100 нМ или 1 мкМ CX-5461 в течение 3 часов. РНК экстрагировали и определяли уровни предшественников 47S рРНК с использованием праймеров, специфичных к 5’ETS пре-рРНК. Уровни экспрессии были нормализованы к мРНК NONO и выражены как кратное изменение по сравнению с носителем ( n  = 3 биологически независимых эксперимента), планки погрешностей представляют собой среднее  ± SEM, статистический анализ проводили с использованием двустороннего одностороннего ANOVA, множественного Тьюки. сравнительный тест (показаны скорректированные значения p ).

Затем мы исследовали образование гибридов РНК:ДНК (R-петли), которые являются побочными продуктами транскрипции Pol I. Известно, что стабилизация этих трехцепочечных структур нуклеиновых кислот, состоящих из гибрида ДНК-РНК и смещенной одноцепочечной ДНК, препятствует репликации ДНК и активирует DDR 32 . Недавно было показано, что стабилизация R-петлей совпадает с ингибированием транскрипции Pol I и активацией ядрышковой DDR после мягкого гипоосмотического стресса 33 . Чтобы пометить ядрышковые R-петли, мы выполнили co-IF для вышестоящего связывающего фактора транскрипции (UBF), который локализуется в деконденсированном хроматине рДНК 34,35 .Наблюдалось поразительное изменение в окрашивании ядрышек R-петли: от слабого и диффузного в контрольных OVCAR8 и OVCAR4 до фокальной картины с более интенсивными очагами в клетках, обработанных CX-5461 (рис. 4c, d и дополнительная рис. 5A–C). . Это позволяет предположить, что CX-5461-индуцированное смещение Pol I с промоторов рДНК 19,36 связано со стабилизацией R-петлей, возможно, из-за ингибирования инициации, совпадающего с ингибированием процессинга рРНК-предшественников, что приводит к стабилизации R-петлей из транскрипты, уже генерированные удлинением молекул Pol I.Интересно, что клетки RAD51C KO OVCAR8 демонстрировали высокий базальный уровень ко-транскрипционных R-петлей (рис. 4c, d), совпадающий с более высокой базовой скоростью транскрипции рДНК по сравнению с родительскими клетками (рис. 4e). Таким образом, эти данные указывают на активность RAD51C и/или HR в негативной регуляции транскрипции Pol 1. Однако истощение RAD51C не сочеталось с обработкой 100 нМ или 1 мкМ CX-5461 в дальнейшем снижении транскрипции рДНК или в усилении накопления ядрышковых R-петлей по сравнению с клетками OVCAR8, обработанными CX-5461.

Чтобы оценить стресс репликации рДНК, мы проверили, индуцирует ли CX-5461 ATR в ядрышках (рис. 5а). Действительно, pATR T1989 был обнаружен после обработки CX-5461 на периферии ядрышковых R-петлей, совместно локализуясь с UBF в клетках OVCAR8 и OVCAR4, обработанных CX-5461 (рис. 5a, b, дополнительная рис. 5d-). f и дополнительный рисунок 6a). Локализация ATR на периферии ядрышек согласуется с хорошо охарактеризованным движением поврежденной рДНК к точкам закрепления на периферии ядрышка, где она более доступна для факторов репарации ДНК 37 .Активация ATR в ответ на CX-5461 не ограничивалась ядрышками в клетках S-фазы и индуцировалась в популяциях EdU-отрицательных и EdU-положительных HR-дефектных клеток (рис. 5a, b). Эти данные свидетельствуют о том, что ATR активируется в ответ на индуцированные CX-5461 дефекты репликации ДНК, возникающие в S-фазе и в ответ на дополнительные дефекты, не зависящие от клеточного цикла. Чтобы выяснить, требуется ли активация DDR в нереплицирующихся клетках для опосредованного CX-5461 ингибирования роста, мы проанализировали влияние обработки CX-5461 на отсортированные клетки G1, S и G2, меченные FUCCI OVCAR8 и RAD51C KO OVCAR8 (дополнительная рис. .6Б). Независимо от стадии клеточного цикла лечение CX-5461 приводило к остановке клеточного цикла G2. Из-за отсутствия активности p53 в клетках OVCAR8 остановка контрольной точки G2, по-видимому, является основным ответом на CX-5461, что позволяет предположить, что репликация ДНК необходима для ингибирующего действия CX-5461 на рост.

Рис. 5: CX-5461 активирует DDR.

a Co-IF анализ pATR (T1989) и UBF в клетках, меченных EdU и обработанных носителем или 1 мкМ CX-5461 в течение 3 часов. Репрезентативные изображения трех биологически независимых экспериментов. b Количественное определение интенсивности сигнала совместно локализованных областей pATR/UBF и общего pATR проводили с использованием CellProfiler и нормализовали к среднему значению контролей, получавших носитель. n  = 464 EdU-положительных клеток и n  = 250 EdU-отрицательных клеток на условие лечения исследовали в трех биологически независимых экспериментах. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с использованием двустороннего одностороннего ANOVA, критерия множественных сравнений Крускала-Уоллиса (показаны скорректированные значения p ). c Co-IF анализ pRPA32 (S33) и UBF в клетках, меченных EdU и обработанных носителем или 1 мкМ CX-5461 в течение 3 часов. Репрезентативные изображения трех биологически независимых экспериментов. d Количественное определение интенсивности сигнала совместно локализованных областей pRPA/UBF и общего количества pRPA проводили с использованием CellProfiler и нормализовали к среднему значению контролей, получавших носитель. n  = 216 EdU-положительных и n  = 270 EdU-отрицательных клеток на условие лечения исследовали в трех независимых экспериментах.Столбики погрешностей представляют собой среднее ± ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили с использованием одностороннего одностороннего ANOVA, критерия множественных сравнений Крускала-Уоллиса (показаны скорректированные значения p ).

ОцДНК, покрытая RPA, рекрутирует и активирует многочисленные регуляторы репарации ДНК и контрольных точек клеточного цикла, включая ATR. ATR фосфорилирует RPA32 на S33 сразу после остановки вилки 31 . Поэтому мы исследовали фосфорилирование S33 RPA32 при обработке CX-5461 и наблюдали значительную локализацию pRPA32 S33 в ядрышках как в HR-продуцирующих, так и в HR-дефицитных клетках (фиг.5в-г). CX-5461-опосредованное S33-фосфорилирование RPA не зависело от стадии клеточного цикла и не ограничивалось ядрышками в HR-дефицитных клетках. Таким образом, образование структур оцДНК в клетках, обработанных CX-5461, может привести к остановке вилки репликации и активации ATR с HRD, усугубляя опосредованный CX-5461 стресс репликации, и это может лежать в основе синтетического летального взаимодействия CX-5461 с HRD.

Затем мы оценили вклад стабилизации R-петлей в опосредованную CX-5461 токсичность за счет сверхэкспрессии рибонуклеазы H 1 (РНКазы H), которая специфически разрушает фрагмент РНК в гибридах РНК:ДНК 38 для предотвращения стабилизации R-петли в RAD51C Клетки KO OVCAR8 (дополнительный рис.7А). Сверхэкспрессия РНКазы H снижала уровни ядрышковых R-петлей в клетках OVCAR8 RAD51C KO, обработанных CX-5461, по сравнению с контрольным носителем, однако это не предотвращало опосредованное CX-5461 S33 фосфорилирование RPA в течение 3 часов после обработки, что указывает на присутствие одноцепочечной ДНК и разветвления. остановка (дополнительный рис. 7B, C). Через 24 ч после обработки CX-5461 избыточная экспрессия РНКазы H частично снижала глобальный стресс репликации, отмеченный фосфорилированием RPA32 S4/S8, однако это не устраняло эффекты ингибирования роста CX-5461 (дополнительная рис.7Г, Д). В целом, наши данные указывают на то, что CX-5461 индуцирует структуры оцДНК и стресс репликации в рДНК, при этом стабилизация R-петлей указывает на дефекты хроматина в рДНК и способствует CX-5461-опосредованной DDR, но не является существенной для эффективности CX-5461.

CX-5461 сотрудничает с PARPi в индукции стресса репликации

Затем мы исследовали образование очагов γh3AX после 3-часовой обработки CX-5461, когда было обнаружено фосфорилирование ATR и RPA. CX-5461 индуцировал глобальные очаги γh3AX только в EdU-положительной популяции HR-способных клеток OVCAR8, что позволяет предположить, что вызванное CX-5461 повреждение ДНК связано с репликацией ДНК (фиг.6а, б). HR-дефицитные клетки RAD51C KO OVCAR8, обработанные CX-5461, демонстрировали высокие уровни активации фокусов ATR (рис. 5b) и γh3AX (рис. 6a, b) как в EdU-положительных, так и в -отрицательных популяциях. Эти данные свидетельствуют о том, что стресс репликации является не единственной причиной повреждения ДНК, вызванного CX-5461. Однако наши данные с использованием отсортированных клеток G1 с использованием системы FUCCI (дополнительная рис. 6b) продемонстрировали, что DDR, индуцированная CX-5461, не влияла на клетки G1, которые прогрессировали до G2 до ареста, что позволяет предположить, что репликация ДНК необходима для ингибирования роста CX-5461. эффекты.

Рис. 6: CX-5461-индуцирует зависимое от репликации повреждение ДНК в клетках HGSOC с высоким уровнем HR.

a Co-IF анализ γh3AX в клетках, меченных EdU и обработанных носителем или 1 мкМ CX-5461 в течение 3 часов. Репрезентативные изображения трех биологически независимых экспериментов. b Количественное определение очагов проводили с помощью CellProfiler. n  = 250 EdU-положительных клеток и n  = 220 EdU-отрицательных клеток на условие лечения исследовали в трех независимых экспериментах.Столбики погрешностей представляют собой среднее ± ± стандартное отклонение. c Длина дорожки IdU уменьшена CX-5461 с помощью механизма, зависящего от MRE11. Схема используемого метода маркировки импульсов CIdU и IdU (вверху). Клетки OVCAR8 последовательно метили и либо обрабатывали, либо обрабатывали 1 мкМ CX-5461, 50 мМ мирина или их комбинацией в течение 3 часов. Волокна обрабатывали для анализа волокон ДНК. Длина репликационной вилки была рассчитана на основе длины отдельных дорожек IdU, измеренных с помощью программного обеспечения ImageJ. Длины дорожек IdU (в мкм) были преобразованы в kb (1 kb = 2.59  мкм). n  = 150 треков репликации были проанализированы в двух биологически независимых экспериментах. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± ± стандартное отклонение. d Анализ волокон ДНК клеток OVCAR8, предварительно обработанных 100 нМ CX-5461, 100 нМ BMN-673 или в комбинации, промытых, а затем последовательно меченных CldU и IdU, как показано на схеме (вверху). Волокна обрабатывали и анализировали, как описано выше. n  = 150 треков репликации были проанализированы в двух независимых экспериментах. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± ± стандартное отклонение.Статистический анализ (в b d ) был выполнен с использованием двустороннего одностороннего ANOVA, критерия множественных сравнений Крускала-Уоллиса (показаны скорректированные значения p ). NS означает незначительное p -значение > 0,05.

BRCA1/2 и RAD51 играют важную роль в стабилизации вилок репликации после репликационного стресса, предотвращая нуклеолитическую деградацию вилок репликации нуклеазой MRE11 39 . Поэтому мы провели анализ волокон ДНК, чтобы исследовать влияние CX-5461 на стабилизацию вилки (рис.6c и дополнительный рисунок 8A) в клетках OVCAR8. Треки зарождающейся репликации были последовательно помечены CldU и IdU перед обработкой CX-5461 в течение 3 часов. Обработка CX-5461 вызывает общее уменьшение длины дорожки, что свидетельствует о деградации вилок репликации при индукции DDR с помощью CX-5461. Это было устранено совместным лечением мирином, ингибитором MRE11, что подтверждает, что ингибирование нуклеазы MRE11 может устранить дестабилизацию вилки, опосредованную CX-5461. Затем мы оценили, влияет ли повреждение ДНК, вызванное обработкой CX-5461, на прогрессирование разветвления путем предварительной обработки клеток CX-5461 в течение 24 часов, а затем импульсной метки обоими аналогами (рис. 6г). Предварительная обработка CX-5461 не повлияла на длину вилки, что позволяет предположить, что CX-5461 не вызывает никаких повреждений, которые могли бы повлиять на перезапуск или прогрессирование вилки. С др. стороны, PARPi talazoparib (BMN-673) увеличивал развитие вилки в согласии с недавним сообщением о вовлечении PARPi-опосредованного ускорения удлинения вилки как механизма стресса репликации и повреждения ДНК 40 . Таким образом, наши данные демонстрируют, что CX-5461 и PARPi вызывают стресс репликации посредством различных эффектов на дестабилизацию вилки, что указывает на независимые синтетические летальные взаимодействия с HRD.Более того, комбинация CX-5461 и BMN-673 привела к значительному увеличению образования очагов γh3AX в HR-продуцирующих и HR-дефицитных клетках (рис. 7a, b), что свидетельствует об их сотрудничестве в усугублении стресса репликации и повреждения ДНК. Поскольку путь HR необходим для противодействия стрессу репликации путем стабилизации застопорившихся вилок репликации, мы также исследовали активацию пути HR после лечения CX-5461. Мы обнаружили, что CX-5461 индуцирует образование очагов RAD51, что указывает на загрузку RAD51 на DSB, в то время как комбинация CX-5461 и BMN-673 приводит к дальнейшему усиленному образованию очагов RAD51 (рис.7а, б). Таким образом, CX-5461-опосредованная DDR активирует HR вплоть до стадии загрузки RAD51, а ее взаимодействие с BMN-673 при обострении стресса репликации усиливает активацию пути HR. Кроме того, в соответствии с активацией CX-5461 MRE11-опосредованной деградации вилки, CX-5461 индуцирует pRPA S4/S8, маркер остановленных репликационных вилок в клетках RAD51C KO OVCAR8 с дефицитом HR, но более сильно в клетках RAD51C KO OVCAR8 с дефицитом HR (рис. 7C). Кроме того, CX-5461 сотрудничает с BMN-673 в индукции уровней pRPA S4/S8 в HR-дефицитных клетках OVCAR8 RAD51C KO.Таким образом, CX-5461, PARPi и HRD взаимодействуют в усилении стресса репликации. В совокупности наши данные согласуются с моделью (рис. 7D), согласно которой CX-5461 ингибирует рекрутирование Pol I, что приводит к дефектам хроматина рДНК, включая образование одноцепочечной ДНК и стресс репликации рДНК. CX-5461 также вызывает глобальный стресс репликации, связанный с остановкой и дестабилизацией вилок репликации посредством активности MRE11, что приводит к повреждению ДНК. HRD потенцирует репликационный стресс, опосредованный CX-5461. Комбинация CX-5461 и PARPi еще больше усугубляет стресс репликации, и это лежит в основе синтетических летальных взаимодействий PARPi/CX-5461/HRD (рис.7г).

Рис. 7: CX-5461 и BMN-673 индуцируют маркеры стресса репликации и повреждения ДНК в клетках OVCAR8 и OVCAR8 RAD51C KO.

a Клетки OVCAR8 инкубировали с 10 мкМ EdU перед обработкой носителем, 100 нМ CX-5461, 100 нМ BMN-673 или их комбинацией в течение 24 часов. Co-IF для γh3AX и RAD51 проводили. Клетки инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с реакцией Click-IT, промывали PBS и затем докрашивали DAPI. Репрезентативные изображения трех биологически независимых экспериментов. b Количественное определение очагов γh3AX. n  = 554 клеток OVCAR8 и n  = 708 клеток OVCAR8 RAD51C KO на условие обработки анализировали в течение трех биологически независимых экспериментов. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± ± стандартное отклонение. Количественное определение очагов RAD51 в EdU-положительных клетках. n  = 223 клеток EdU +ve OVCAR8 и n  = 221 клеток OVCAR8 RAD51C KO на условие лечения проанализировано в трех независимых экспериментах. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± ± стандартное отклонение.Статистический анализ проводили с использованием двустороннего одностороннего ANOVA, критерия множественных сравнений Тьюки (показаны скорректированные значения p ). c Вестерн-блот-анализ клеток, обработанных, как в ( a ). Представитель n  = 2 биологически независимых экспериментов. Показанные блоты представляют собой образцы, полученные из одного и того же эксперимента и обработанные параллельно. Полные размеры сканирования вестерн-блотов представлены на дополнительном рисунке 10. d Схема молекулярного ответа на CX-5461.CX-5461 ингибирует транскрипционный комплекс Pol I, связываясь с комплексом селективности 1 (SL-1) и предотвращая связывание Pol I с промоторами генов рРНК. Смещение Pol I и ингибирование инициации транскрипции Pol I связаны со стабилизацией R-петлей, привлечением RPA к одноцепочечной рДНК, стрессом репликации рДНК и активацией DDR в ядрышках. CX-5461 также вызывает глобальный стресс репликации, связанный с остановкой и дестабилизацией вилок репликации посредством активности MRE11, что приводит к повреждению ДНК, S-фазе и остановке клеточного цикла G2/M.Путь HR и активность PARP необходимы для противодействия стрессу репликации ДНК. CX-5461 взаимодействует с HRD и ингибированием активности PARP, усугубляя стресс репликации и повреждение ДНК, способствуя гибели клеток.

CX-5461 взаимодействует с PARPi для ингибирования роста клеток HGSOC

Поскольку CX-5461 в сочетании с BMN-673 приводит к повышенному повреждению ДНК, мы предположили, что сочетание CX-5461 с PARPi или другими ингибиторами репарации ДНК и DDR (терапия DDR) ) может повысить эффективность лечения HGSOC.Поэтому мы провели целенаправленный / бутик-скрининг лекарств в клетках OVCAR4, обладающих способностью к репарации HR, на предмет репарации ДНК и ингибиторов DDR, которые могут взаимодействовать с CX-5461 для усиления остановки роста (рис. 8a). Ингибиторы ATM (ATMi: KU55933), ATR (ATRI: VE-821), PARP (BMN-673), химиотерапевтический препарат на основе платины цисплатин, ингибитор mTORC1 эверолимус и селективный ингибитор BCL-2 ABT-199 продемонстрировали ингибирующие рост эффекты в качестве отдельных агентов. Однако комбинация GI 20 дозы CX-5461 с BMN-673 и VE-821 (ATRI) показала наиболее усиленную остановку пролиферации по сравнению с эффектами одного агента и по сравнению с комбинациями с другими соединениями (рис.8а). Затем мы изучили взаимодействие между CX-5461 и BMN-673 или ATRi в индукции гибели клеток в трех дополнительных HR-способных клеточных линиях HGSOC (дополнительная рис. 3C) и выявили надежные и значимые взаимодействия между BMN-673 и CX-5461 в индукции гибель клеток по сравнению с ATRi (VE-821) (рис. 8b). Кроме того, кривые доза-реакция BMN-673 в присутствии или в отсутствие CX-5461 подтвердили сильное взаимодействие CX-5461 с BMN-673 (рис. 8c). Кроме того, комбинация CX-5461 и BMN-673 приводила к усиленной остановке клеточного цикла G2/M, усиленному ингибированию клеточной пролиферации (фиг. 8d-e) и значительно снижает клоногенную выживаемость HR-продуцирующих (OVCAR8 и OV90) и HR-дефицитных (OVCAR8 RAD51C KO) клеток. Для сравнения, снижение чувствительности к отдельным агентам и комбинации в эпителиальных клетках фаллопиевой трубы человека, иммортализованных FT282, демонстрирует явное терапевтическое окно для этих методов лечения (рис. 8f, g).

Рис. 8: CX-5461 совместно с PARPi ингибирует рост клеток HGSOC.

a Мини-скрининг на наркотики в клетках OVCAR4, обработанных возрастающими дозами цисплатина (0–1.11 мкМ), PARPi (BMN-673, 0–0,11 мкМ), ATMi (KU55933, 0–1,11 мкМ), ATRi (VE-821, 0–1,11 мкМ), ABT-119 (0–1,11 мкМ) или эверолимус ( 0–0,11 мкМ) ± 80 нМ (GI 20 ) CX-5461. Цветовое кодирование обозначает уровень пролиферации, измеренный окрашиванием DAPI и визуализацией с использованием Cellomics (зеленый цвет обозначает снижение пролиферации). Дозозависимая реакция при лечении одним лекарственным средством была скорректирована с учетом контроля носителя, а комбинация была скорректирована с учетом реакции на 80 нМ CX-5461, представлены средние значения n  = 5. Комбинация CX-5461 с BMN-673 или ATRi выделена желтыми прямоугольниками. b Количественное определение содержания ДНК SubG1 путем окрашивания PI клеток, обработанных носителем, 100 нМ CX-5461, 1 мкМ VE-821, 100 нМ BMN-673 или в комбинации в течение 7 дней ( n  = 3 биологически независимых эксперимента) . Столбики погрешностей представляют собой среднее ± SEM. Стратегия гейтирования проточной цитометрии показана на дополнительном рисунке 3D. C) Репрезентативные кривые доза-эффект BMN-673 ± 30 нМ CX-5461. Пролиферацию клеток измеряли с помощью анализов SRB через 5 дней после обработки.Кривые доза-ответ для BMN-673 были скорректированы для контроля обработки ДМСО, а комбинация была скорректирована для ответа на 30 нМ CX-5461. Представитель трех биологических повторностей. Столбики погрешностей представляют собой среднее  ± SEM для n  = 5 технических повторов. d Анализ клеточного цикла BrdU клеток, обработанных носителем, 1 мкМ CX-5461, 100 нМ BMN-673 или в комбинации в течение 72 ч, как описано на рис. 3b и дополнительном рис. 3D. n  = 3, среднее значение ± SEM. e Динамика пролиферации in vitro, оцененная по слиянию клеток с использованием IncuCyte ZOOM.Представитель n  = 3 биологических повторов, среднее значение ± SEM пяти технических повторов. Пунктирные линии обозначают повторное добавление в среду препаратов. f CX-5461 и BMN-673 совместно ингибируют клоногенное выживание. Репрезентативное изображение n  = 6 биологически независимых экспериментов для клеток OVCAR8 и OVCAR8 RAD51C KO и n  = 3 биологических повторов для клеток FT282, среднее  ± SEM. г Клоногенный анализ клеток OV90. n  = 3 технических повтора.Статистический анализ (в b , d и f ) был выполнен с использованием двустороннего одностороннего ANOVA, критерия множественных сравнений Тьюки (показаны скорректированные значения p ).

Затем мы исследовали эффекты комбинирования CX-5461 с BMN-673 на скорость транскрипции Pol I на основании того факта, что ядрышковый PARP1 участвует в регуляции гетерохроматина рДНК 41 . После 3-часовой обработки CX-5461 мы обнаружили значительное снижение уровней предшественников рРНК (дополнительная рис.8Б). Однако комбинация CX-5461 с BMN-673 не приводила к дальнейшему снижению содержания рРНК по сравнению с образцами, обработанными CX-5461. Таким образом, наши данные предполагают, что CX-5461 взаимодействует с PARPi, вызывая остановку роста и гибель клеток, усугубляя стресс репликации и повреждение ДНК (рис. 7d), в отличие от усиления ингибирования транскрипции Pol I.

CX-5461 обладает значительной терапевтической эффективностью в моделях HGSOC

Затем мы исследовали потенциал взаимодействия CX-5461 и PARPi in vivo у BRCA2 -мутированных, дефицитных по HR после одной линии лечения платиной HGSOC-PDX (# 19Б).Введение CX-5461 и олапариба в качестве отдельных агентов приводило к стабилизации заболевания и статистически значимому улучшению выживаемости (среднее время до сбора урожая (в этической конечной точке) (TTH) для лечения CX-5461 53 дня, олапариба 67 дней по сравнению с носителем 22 дня, p -значения 0,00285 и 0,00285 по сравнению с носителем соответственно) (рис. 9а). Совместное лечение CX-5461 и олапарибом хорошо переносилось (дополнительная рис. 9A) и приводило к резкому длительному регрессу с уменьшением объема опухоли, указывающим на частичную ремиссию (определяемую как уменьшение объема опухоли> 30% от исходного уровня) с длительной выживаемостью. более 100 дней (медиана TTH 113 дней, p — значения 0.00692 по сравнению с лечением одним агентом CX-5461).

Рис. 9: CX-5461 обладает значительной терапевтической эффективностью в моделях HGSOC ксенотрансплантатов (PDX), полученных от пациентов.

a Ответы, наблюдаемые у обработанных платиной BRCA2-мутантных PDX#19 HGSOC-PDX и b PDX #62 с метилированием промотора BRCA1 до CX-5461 и лечением олапарибом in vivo. Реципиентные мыши, несущие PDX, были рандомизированы для лечения носителем, 40 мг/кг CX-5461 два раза в неделю, 50 мг/кг олапариба один раз в день или комбинацией CX-5461/олапариб в течение 3 недель.PDX собирали при объеме опухоли 700 мм 3 . Средний объем опухоли (мм 3 ) (сплошные линии) ±95% ДИ (заштрихованная область) и объем опухоли у всех отдельных мышей (штриховые линии) и соответствующий анализ выживаемости Каплана-Мейера. Цензурированные события представлены крестиками на графике Каплана-Мейера. n указывает на отдельных мышей. c Схема маркировки импульсов CIdU и IdU (вверху). Клетки OVCAR8 RAD51C KO или клеточную линию d WEHICS62, полученную из PDX#62 29 , последовательно метили и либо обрабатывали, либо обрабатывали 2 мМ гидроксимочевины (HU) ± 1 мкМ CX-5461 в течение 3 ч.Волокна обрабатывали для анализа волокон ДНК. n  = 102 трека репликации клеток OVCAR8 RAD51C KO проанализированы в двух независимых экспериментах, n  = 236 треков репликации клеток WEHICS62 проанализированы в трех независимых экспериментах. Столбики погрешностей представляют собой среднее ± ± стандартное отклонение. Статистический анализ в (C) был выполнен с использованием двустороннего критерия Манна-Уитни, а в ( d ) с использованием двустороннего одностороннего ANOVA, критерия множественных сравнений Тьюки (показаны скорректированные значения p ). NS обозначает незначительное p -значение. e Анализ Co-IF pATR (T1989) и UBF в клетках WEHICS62, обработанных носителем или 100 нМ CX-5461 в течение 24 часов. Количественную оценку интенсивности сигнала колокализованных областей и общего pATR проводили с использованием CellProfiler. n  = 506 клеток на состояние, проанализированное в трех независимых экспериментах, планки погрешностей представляют собой среднее  ± SD. Статистический анализ проводили с использованием критерия Манна-Уитни. f Анализ клеточного цикла BrdU клеток WEHCS62, обработанных носителем или 1 мкМ CX-5461, в течение 72 ч (левая панель), n  = 3 биологических повтора, среднее значение ± SEM.Стратегия гейтирования проточной цитометрии показана на дополнительном рисунке 3D. Статистический анализ проводили с использованием двустороннего одностороннего ANOVA, критерия множественных сравнений Тьюки (показаны скорректированные значения p ). Динамика пролиферации CX-5461 in vitro «доза-ответ», оцененная с использованием IncuCyte ZOOM. Представитель n  = 3 биологических повторов, среднее значение ± SEM пяти технических повторов.

Чтобы сравнить эффективность CX-5461 in vivo со стандартной терапией, мы исследовали активность CX-5461 в HGSOC-PDX, ранее не получавшем химиотерапию, который демонстрировал гиперметилирование промотора BRCA1 и ранее был охарактеризован как устойчивые/рефрактерные к цисплатину 44 и реагирующие только на высокую дозу (300 мг/кг) рукапариба PARPi.PDX#62 не реагировал на 150 мг/кг рукапариба 29,42 и, в отличие от PDX#19B, также не реагировал на 50 мг/кг олапариба, демонстрируя прогрессирующее заболевание с увеличением объема опухоли >20% от исходного уровня в 8 дней после лечения (рис. 9b). Для сравнения, терапия CX-5461 привела к стабилизации заболевания и статистически значимому улучшению выживаемости (медиана TTH для лечения CX-5461 92 дня по сравнению с носителем 32 дня и олапарибом 36 дней, p -значения 0,0004 и 0,0022 по сравнению с носителем и олапарибом, соответственно). При более высокой дозе олапариба (100 мг/кг) PDX#62 также продемонстрировал прогрессирующее заболевание, что подтверждает его сниженный ответ на олапариб (дополнительная фигура 9B). В обоих экспериментах на выживание PDX#62 CX-5461 продемонстрировал значительную терапевтическую эффективность одного агента, однако комбинация CX-5461 и олапариба не давала дополнительного улучшения выживаемости.

Ранее охарактеризованная клеточная линия WEHICS62 29 , полученная из PDX # 62, демонстрирует сниженную способность HR (дополнительные рис. 3A и B). Однако анализ волокон ДНК показал, в отличие от эффектов, наблюдаемых в HR-дефицитных клетках OVCAR8 RAD51C KO, вилки, остановленные гидроксимочевиной (HU), не деградировали в клетках WEHICS62, что указывает на защиту вилки (рис.9c, d), механизм, связанный с PARPi-резистентностью в BRCA1-дефицитных раковых клетках 43 . Обработка дестабилизированных вилок CX-5461 и комбинация с повышенной нестабильностью вилки HU. Таким образом, наши данные демонстрируют, что CX-5461 преодолевает защиту от вилки в клетках, устойчивых к олапарибу. Обработка CX-5461 клеток WEHICS62 привела к стабилизации ядрышковых R-петлей, что свидетельствует о дефектах хроматина рДНК (дополнительная рис. 9C), однако сверхэкспрессия РНКазы H лишь частично снизила индукцию CX-5461 pRPA32 S4/S8 и не спасла CX-5461. ингибирующие рост эффекты (дополнительный рис.9D и Е). Примечательно, что CX-5461 индуцирует активацию ATR, надежную остановку клеточного цикла G2/M и ингибирование пролиферации (рис. 9e–f и дополнительная рис. 9F). Важно отметить, что PDX#62, характеризующийся устойчивостью/рефрактерностью к цисплатину, содержит амплификации во множестве связанных с раком генов и повышенную экспрессию Cyclin E и MYCN 42 , которые, как известно, связаны с устойчивостью к препаратам платины. Терапевтический ответ на CX-5461 в PDX#62 согласуется с сигнатурой экспрессии генов-мишеней MYC, связанной с чувствительностью к CX-5461 (фиг.2а). В целом наши данные показали, что CX-5461 имеет важное клиническое значение для лечения пациентов с резистентной к олапарибу OVCA и пациентов с опухолями с высокой активностью MYC и плохим клиническим исходом 1 .

Чтобы оценить потенциал терапии CX-5461 при лечении HGSOC, мы затем изучили распространенность признаков чувствительности CX-5461 (рис. 2a) в образцах опухолей HGSOC. Мы исследовали 81 образец первичной опухоли яичника (рис. 10а), из которых 21 (26%) демонстрировали сигнатуры экспрессии генов с мутациями MYC_UP и BRCAm, чувствительные к CX-5461.Эти опухоли III и IV стадий по-разному реагировали на химиотерапию: 2 прогрессировали во время химиотерапии и 13 рецидивировали после терапии (рис. 10a), что позволяет предположить, в соответствии с нашими доклиническими данными, что CX-5461 может иметь различный спектр чувствительности к химиотерапии. в клинике.

Рис. 10: Обнаружение сигнатуры экспрессии гена чувствительности к CX-5461 в первичных и рецидивных образцах HGSOC.

a Клинические данные и данные экспрессии гена РНК-seq из 81 образца первичной опухоли яичников из австралийской когорты пациентов с раком яичников из Международного консорциума генома рака (ICGC) [https://dcc. icgc.org/] (выпуск 27). Уровень экспрессии сигнатур чувствительности CX-5461 рассчитывали с использованием ssGSEA в отдельных образцах. Показатели ssGSEA были нормализованы линейным преобразованием к диапазону 0–1 для сравнения. b Показатели ssGSEA были рассчитаны, как в ( a ) в 25 образцах асцита от пациентов с рецидивом из ICGC. c Кластеризация образцов асцита от пациентов с рецидивом с клеточными линиями была основана на сигнатурах MYC_UP-sig и BRCAm-sig с использованием k -средних с k  = 4. d Анализ MYC_UP-sig и BRCAM-sig в ​​трех соответствующих образцах первичной опухоли из трех образцов с рецидивом в ( c ), обогащенных сигнатурой чувствительности к CX-5461. e Кластеризация образцов в E с образцами клеточных линий на основе сигнатур MYC_UP-sig и BRCAm-sig с использованием k -средних с k  = 4.

Кроме того, мы исследовали 25 рецидивирующих (асцитных) образцов из которых 4 образца (16%) демонстрировали признаки чувствительности CX-5461 (рис. 10б, в). Таким образом, CX-5461 обладает захватывающим потенциалом в качестве терапевтического варианта для подмножества рецидивов OVCA. Интересно, что соответствующая первичная опухоль из трех рецидивирующих опухолей, предположительно реагирующая на CX-5461, не проявляла признаков чувствительности к CX-5461 (рис. 10d, e). Таким образом, развитие резистентности к химиотерапии связано с изменениями, облегчающими эффективность CX-5461.

Характеристика: Велосипед Focus Mares Force 1 CX 2018 года, который можно использовать как гравийный велосипед

Focus Bikes — производитель велосипедов, базирующийся в Клоппенберге, Германия.Его немецкие корни приписывают основателю компании Майку Клюге, бывшему чемпиону мира по велокроссу. Велосипеды Focus хорошо известны в Соединенных Штатах, особенно в мире велокросса.

Велосипед, представленный в этой статье, Focus Mares Force 1 2018 года, предназначен для мира велогонок. Если вы смотрели мое предыдущее видео об использовании велосипеда для велокросса в качестве гравийного велосипеда (реальный опыт), вы увидите, как я и другие люди используют эти велосипеды для езды и гонок по гравийным дорогам — такова их универсальность.

Линейка велосипедов для велокросса Focus Mares представлена ​​на рынке уже несколько лет, но в течение этого времени компания Focus постоянно работала над усовершенствованием велосипеда.

Нравится вам это или нет, но краска «Желтый фристайл» на буровой установке Focus Mares Force 1 CX 2018 года выделяется из толпы.

Начиная с передней части Mares CX рулевая колонка короче, чем у некоторых гравийных велосипедов. Поскольку этот байк разработан исключительно для гонок велокросса, геометрия была оптимизирована для этого, а это означает, что на гравийной дороге управляемость будет немного более нервной, чем некоторые могут привыкнуть или чувствовать себя комфортно.

В наши дни полностью карбоновая вилка сужается от 1 1/8 дюйма вверху до 1 1/2 дюйма внизу рулевой трубы.

Mares Force 1 использует технологию плавающей оси Focus R.A.T на обоих концах велосипеда. Обязательно посмотрите наше видео о Focus R. A.T. система и как она работает.

Как следует из номенклатуры Force 1 в названии этой модели Focus, она оснащена механическим переключением передач / гидравлическим тормозом SRAM Force 1.

Трансмиссии с одной звездой подходят не всем, но нельзя отрицать, что они идеально подходят для велокросса. В мире езды по гравию и гонок все больше и больше производителей гонщиков устанавливают на свои велосипеды системы 1x (в этом видео мы опросили нескольких гонщиков о 1x и 2x). Обратите внимание на переднюю звезду с 42 зубьями на шатуне.

Каретка PF30 скрыта от глаз.

Компания SRAM вложила много времени, денег и усилий в разработку групсета SRAM Force 1.Нельзя сомневаться в том, насколько хорошо они работают.

Задний переключатель SRAM 1 Force оснащен муфтой, которая устраняет дребезг переключателя и удар цепи. Кассета с велосипедом Mares Force 1 CX 2018 года имеет соотношение SRAM PG1170 11-32.

Несмотря на почти пуленепробиваемый характер трансмиссии SRAM 1x, Focus мудро установил защиту от падения цепи, чтобы предотвратить немыслимое.

Модель Focus Mares Force 1 поставляется с шинами Continental Cyclo-X King размером 700c x 35 мм.Вокруг шины по-прежнему имеется достаточный зазор, что делает этот байк хорошим кандидатом для перехода на темную сторону — веселую сторону — езду по гравию и гонки!

Направляющая кабеля на фотографии выше также указывает на то, что вы можете использовать трансмиссию 2x с Focus Mares Force 1. Еще один показатель того, что Mares может быть оснащен трансмиссией 2x.

Uber cool colorway на подседельной трубе и второе крепление для флягодержателя — еще один признак того, что Focus не планировал этот велосипед только для велокросса.

Рама Focus Mares CX на 100 % состоит из карбона, вплоть до изогнутого тормозного моста.

Focus использует конструкцию с плоским креплением для установки тормозов на свои велосипеды. Передний тормозной диск диаметром 160 мм.

Плоское крепление для заднего тормоза вместе со 140-мм ротором заднего дискового тормоза.